侯亞萍，楊潔霞，郭芳芳，齊一鳴，彭海山，王東梅，歐陽浩新，尹愛華△

(1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣州 511442；2.廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣州 511442)

目前，我國的出生缺陷發(fā)病率為4%～6%，每年新增出生缺陷兒高達80～120萬[1]，而染色體異常在其中占重要比例[2]。迄今為止，染色體異常尚無有效的治療手段，故早期的產(chǎn)前篩查及診斷尤為重要。目前，預(yù)防出生缺陷廣泛應(yīng)用的檢測手段之一是基于血清學(xué)篩查和超聲篩查評估染色體拷貝數(shù)異常的風險，但該檢測方法的靈敏度和準確性不高，篩查假陽性率高，產(chǎn)前診斷率較低[3]。而介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)因其具有有創(chuàng)性，存在對孕婦造成宮內(nèi)感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)等風險，這也一定程度上制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用[4]。1997年，LO等[5]在孕婦外周血中首次發(fā)現(xiàn)了胎兒游離DNA(cffDNA)段，由此為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷奠定了堅實的基礎(chǔ)，使利用孕婦外周血檢測胎兒染色體疾病和基因疾病成為可能。隨著分子遺傳學(xué)及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)技術(shù)以其獨特優(yōu)勢已廣泛用于臨床。本研究通過回顧性分析廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心自愿行NIPT孕婦的產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局，綜合分析NIPT技術(shù)在胎兒染色體非整倍體疾病篩查領(lǐng)域的臨床應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年6月至2015年11月來廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心就診的經(jīng)知情同意自愿接受NIPT的10周以上單胎妊娠孕婦5 946例(近期未接受過異體輸血、細胞治療、移植手術(shù)等，體質(zhì)量<100 kg)作為研究對象，NIPT指征情況：唐氏篩查結(jié)果異常4 525(76.10%)，B超提示異常183例(3.08%)，既往有不良孕產(chǎn)史186例(3.13%)，高齡889例(14.95%)，傳染病19例(0.32%)，錯過唐氏篩查144例(2.42%)。孕婦年齡17～50歲，平均(29.28±2.12)歲。對孕婦均提供遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1血清學(xué)篩查 當天采集孕婦空腹靜脈血2 mL測量胎兒頸項透明層厚度(NT)，分離血清進行測定。采用芬蘭Perkin Elmer公司生產(chǎn)的DELFLA-1235型全自動時間分辨熒光分析儀及配套試劑檢測孕婦人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)和血清甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)水平，并結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、孕周、單/雙胎、是否有吸煙飲酒史、采樣時間等指標，應(yīng)用芬蘭Perkin Elmer公司提供的LifeCycle 3.2唐氏篩查風險軟件進行風險評估。

1.2.2超聲檢查 孕婦在孕早期(11～13+6周)時采用彩色多普勒超聲測量胎兒NT，測量標準參照英國胎兒醫(yī)學(xué)基金會標準。若NT>2.5 mm者，建議進行NIPT或侵入性產(chǎn)前診斷檢查，并跟蹤隨訪妊娠結(jié)局。

1.2.3NIPT 獲得孕婦知情同意且符合條件的孕婦，采用Cell-Free DNA BCTTM管(美國Streck公司)抽取靜脈血10 mL，并立即在4 ℃條件下48 h內(nèi)進行血漿分離并保存于-80 ℃待測。采用QIAamp DNA Micro試劑盒(德國Qiagen公司)進行血漿胎兒游離DNA提取。采用文庫構(gòu)建試劑盒(中國博奧公司)進行測序文庫構(gòu)建后，用Sequencing kit V3測序試劑盒對待測文庫在Proton測序平臺進行測序檢測。通過分析不同染色體水平的差異識別胎兒染色體非整倍體異常，并計算出胎兒患染色體非整倍體疾病的風險概率[6]。

1.3產(chǎn)前診斷及隨訪 對唐氏篩查高危、NT異常者建議進一步行產(chǎn)前診斷檢查，拒絕行產(chǎn)前診斷者可自主選擇NIPT。NIPT結(jié)果提示低風險的孕婦，建議繼續(xù)妊娠并在醫(yī)生指導(dǎo)下進行常規(guī)產(chǎn)前檢查；而結(jié)果提示高風險者，建議行胎兒染色體核型分析，以核實無創(chuàng)檢測結(jié)果的準確性。對所有接受篩查孕婦的妊娠結(jié)局進行跟蹤隨訪。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 本研究中所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2007及SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)專業(yè)分析軟件進行分析處理，其中高通量測序檢測胎兒患染色體非整倍體疾病的風險(21/18/13-三體綜合征等)概率由專用的無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理系統(tǒng)軟件基于二元假設(shè)的Z-score值判斷標準進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1唐氏篩查結(jié)果 在行NIPT的5 946例孕婦中，唐氏篩查異常者4 525例，其中21-三體高風險2 341例(51.73%)，21-三體臨界高風險1 773例(39.18%)，18-三體高風險71例(1.57%)，18-三體臨界高風險28例(0.62%)，其他指標異常312例(6.90%)。

2.2NIPT結(jié)果 在行NIPT的5 946例孕婦中，共檢出62例異常者，其中21-三體高風險17例(27.42%)，18-三體高風險10例(16.13%)，13-三體高風險3例(4.84%)，性染色體異常15例(24.19%)，其他染色體異常17例(27.42%)。

2.3羊水穿刺檢查及妊娠結(jié)局隨訪 見表1。結(jié)合羊水/臍血穿刺及隨訪結(jié)果，本研究5 946例孕婦行NIPT的結(jié)果提示異常者62例，經(jīng)產(chǎn)前診斷及隨訪確診者62例。其中2例NIPT未發(fā)現(xiàn)異常，但后期超聲檢查發(fā)現(xiàn)異常，經(jīng)確認為18-三體綜合征。本研究中NIPT胎兒21/18/13號染色體非整倍體異常的靈敏度為92.59%(25/27)，特異度為99.92%(5 914/5 919)，假陰性率為7.41%(2/27)，假陽性率為0.08%(5/5 919)。NIPT提示性染色體異常的15例中10例經(jīng)羊水/臍血穿刺檢查確診為性染色體異常，而5例經(jīng)進一步檢測及后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)異常。NIPT性染色體異常的靈敏度為100.00%(10/10)，特異度為99.92%(5 931/5 936)，假陰性率為0.00%(0/15)，假陽性率為0.08%(5/5 936)。在NIPT提示其他染色體異常的17例中，僅1例提示18號染色體缺失者經(jīng)羊水穿刺-微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢查結(jié)果為46,XN,del(18)(q22.3)，確認NIPT結(jié)果正確，其他16例經(jīng)進一步檢測及后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討 論

中國每年出生的新生兒約有1 600萬，其中僅因染色體異常引起的新生兒出生缺陷約為0.6%[1,7]。臨床上，胎兒染色體非整倍體是出生缺陷中的主要疾病[2]。隨著國家計劃生育政策放寬，高齡孕婦數(shù)量明顯增多，深入開展產(chǎn)前診斷與篩查，降低出生缺陷，提高人口素質(zhì)顯得尤為重要。目前，我國針對妊娠早、中期18～34歲孕婦推行的是血清學(xué)產(chǎn)前篩查-產(chǎn)前診斷模式。在本研究5 946例行NIPT的孕婦中，唐氏篩查異常者4 525例，占總樣本量的76.10%。但經(jīng)過NIPT和羊水/臍血穿刺檢查及妊娠結(jié)局隨訪結(jié)果的進一步確認可見，唐氏篩查檢測結(jié)果具有假陽性高、特異度差、影響因素較多的特性和不足，故唐氏篩查異常者需進一步進行檢查確認。而被譽為“金標準”的傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法是侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)，因其有創(chuàng)性、風險性，常常給孕婦及家屬造成較大的心理壓力而難以被廣泛接受[4]。尤其現(xiàn)在二胎政策放開后，孕婦數(shù)量，特別是高齡孕婦明顯增多，血清學(xué)篩查及侵入性產(chǎn)前診斷方法已遠遠不能滿足臨床及社會的需求。

由于NIPT技術(shù)具有高通量、自動化、無創(chuàng)、快速等特點，在國內(nèi)外廣受關(guān)注，且該新興技術(shù)已廣泛用于臨床診斷胎兒非整倍染色體異常等方面。本研究中5 946例行NIPT的孕婦中，篩查胎兒21/18/13號染色體非整倍體異常的靈敏度為92.59%(25/27)，特異度為99.92%(5 914/5 919)，假陰性率為7.41%(2/27)，假陽性率為0.08%(5/5919)。靈敏度及特異度稍高，假陽性率及假陰性率與之相似。靈敏度及特異度偏高考慮與樣本量偏小，檢測標本多為唐氏篩查高危者，低風險者比例小有關(guān)。

NIPT是產(chǎn)前篩查手段的巨大進步，也是無創(chuàng)產(chǎn)前檢測未來發(fā)展的趨勢[8]。盡管NIPT具有很多優(yōu)點，但目前仍存在一定局限性，需要進一步優(yōu)化和改進。此外，因NIPT的對象是母體血漿中的胎兒游離DNA，并非直接獲取胎兒的遺傳物質(zhì)，故仍存在假陽性及假陰性的風險。本研究共發(fā)現(xiàn)有2例21-三體假陽性，1例18-三體假陽性，2例13-三體假陽性和2例18-三體假陰性，假陰性率為7.41%，假陽性率為0.08%。初步推測可能與母體因素和胎盤嵌合有關(guān)，目前仍在進行深入驗證分析工作。有研究亦認為，胎兒游離DNA主要源于凋亡的胎盤滋養(yǎng)細胞[9]，故限定性胎盤嵌合體[10]、母體染色體異常[11]、胎盤發(fā)生病變或異常等情況均可影響NIPT結(jié)果的準確性[12]。因此，NIPT結(jié)果為陽性者，建議進一步行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢查進行確認，并及時追蹤隨訪。

綜上所述，NIPT技術(shù)是一種無創(chuàng)、快捷、準確的產(chǎn)前篩查新技術(shù)。隨著NIPT樣本的不斷積累和技術(shù)的優(yōu)化，其準確性和局限性將進一步改善，并將成為產(chǎn)前篩查技術(shù)未來發(fā)展的大趨勢，但目前仍有待完善之處，尚不能取代傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)。故在現(xiàn)有技術(shù)條件下，尚需不斷完善，并與多種產(chǎn)前篩查技術(shù)相互配合，才能提高染色體異常性疾病的檢出率，達到降低出生缺陷發(fā)生率、提高人口素質(zhì)的目的。

[1]孫成銘,欒材富.基因診斷技術(shù)在出生缺陷與遺傳病檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2014,37(4):252-255.

[2]李燕芳，張?zhí)m珍，田耕，等.胎兒游離DNA用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測21、18、13三體綜合征的臨床研究[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2015，16(2):126-129.

[3]ALLDRED S K,TAKWOINGI Y,GUO B,et al.First trimester serum tests for down′s syndrome screening[J].Cochrane Database Syst Rev,2015,30(11):CD011975.

[4]GRACE M R,HARDISTY E,DOTTERS-KATZ S K,et al.Cell-Free DNA Screening:complexities and Challenges of Clinical Implementation[J].Obstet Gynecol Surv,2016,71(8):477-487.

[5]LO Y M,CORBETTA N,CHAMBERLAIN P F,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350 (9076):485-487.

[6]CHIU R W,AKOLEKAR R,ZHENG Y W,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing:large scale validity study[J].BMJ,2011,342(11):c7401.

[7]王慶琴，劉萍，郝明，等.產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查[J].河北醫(yī)藥，2016，38(10):1581-1584.

[8]CUCKLE H,BENN P,PERGAMENT E.Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy as a clinical service[J].Clin Biochem,2015,48(15):932-941.

[9]SIFAKIS S,KOUKOU Z,SPANDIDOS D A.Cell-free fetal DNA and pregnancy-related complications[J].Mol Med Rep,2015,11(4):2367-2372.

[10]MARDY A,WAPNER R J.Confined placental mosaicism and its impact on confirmation of NIPT results[J].Am J Med Genet C Semin Med Genet,2016,172(2):118-122.

[11]VAN OPSTAL D,SREBNIAK M I.Cytogenetic confirmation of a positive NIPT result:evidence-based choice between chorionic villus sampling and amniocentesis depending on chromosome aberration[J].Expert Rev Mol Diagn,2016,16(5):513-520.

[12]TAGLAUER E S,WILKINS-HAUG L,BIANCHI D W.Review:cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease[J].Placenta,2014,35(Suppl 35):S64-S68.