唐鶴文，楊 萌，姜玉新

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科， 北京 100730

光聲成像是一種新型影像技術(shù)，當(dāng)生物內(nèi)源性生色團(tuán)或外源性造影劑，吸收短脈沖的激光后受熱膨脹而產(chǎn)生超聲波，經(jīng)組織表面超聲探頭檢測(cè)、分析處理后即形成了生物組織光能吸收差異分布圖，簡(jiǎn)稱成像。

光聲成像不僅結(jié)合了光學(xué)成像高對(duì)比度和超聲成像高穿透力的優(yōu)勢(shì)，還能通過光聲造影劑獲得組織功能和相關(guān)分子信息，有助于組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理、病理特征和代謝功能等的研究，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

分子影像技術(shù)是采用非侵入性手段，達(dá)到將體內(nèi)分子和細(xì)胞水平生物過程可視化的目的，光聲成像技術(shù)是目前快速增長(zhǎng)的分子影像研究熱點(diǎn)之一。這一技術(shù)現(xiàn)廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并已進(jìn)行了一系列疾病，尤其是腫瘤的臨床前研究，包括檢測(cè)疾病特異性分子表達(dá)水平和監(jiān)測(cè)分子靶向藥物療效等。

光聲成像分子包括內(nèi)源性生色團(tuán)和外源性造影劑兩類。內(nèi)源性生色團(tuán)主要包括血紅蛋白、黑色素、水和脂質(zhì)等。外源性造影劑需要人工合成，其靶向性的外源性分子探針或特異性造影劑，可檢測(cè)到相應(yīng)腫瘤分子標(biāo)志物或異常代謝功能。利用光聲分子造影劑可實(shí)現(xiàn)功能成像，具有重要的臨床意義，也是目前研究的熱點(diǎn)，因此本文對(duì)幾類常見外源性光聲成像分子造影劑進(jìn)行綜述，介紹其物理、化學(xué)、生物學(xué)特性及在臨床前研究中的應(yīng)用。

1 光聲成像分子造影劑的性質(zhì)

理想的光聲成像分子造影劑應(yīng)具有以下光物理特質(zhì)：高摩爾吸光系數(shù)、光穩(wěn)定性、低量子產(chǎn)率(即發(fā)射的光量子數(shù)與吸收的光量子數(shù)比)、近紅外區(qū)(near infrared, NIR)吸收峰。為適應(yīng)生物體內(nèi)應(yīng)用，還應(yīng)具有以下生物學(xué)特性：低毒性、低免疫原性、較小體積，能夠穿過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入組織細(xì)胞并具有與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的能力，能夠被機(jī)體代謝并從循環(huán)系統(tǒng)中清除，另外還應(yīng)易合成，以便大規(guī)模生產(chǎn)。

2 光聲成像分子造影劑的組成與合成

光聲成像分子造影劑由光聲信號(hào)分子與靶標(biāo)的特異性配體分子共同構(gòu)成，二者可通過3種方式合成：(1)小分子化合物直接連接信號(hào)分子和配體。Zhou等[1]用GGGSK直接連接配體多肽QRHKPRE與信號(hào)分子Cy 5.5，檢測(cè)肝癌移植瘤表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的表達(dá)。(2)合成納米結(jié)構(gòu)裝載或結(jié)合信號(hào)分子，配體修飾于納米結(jié)構(gòu)表面。例如用聚乙二醇化脂質(zhì)體-吲哚菁綠(indocyaninegreen,ICG)形成球形納米顆粒，再通過工程技術(shù)將抗體hCTM01結(jié)合于表面，不僅能夠進(jìn)行靶向功能成像，還可在球形納米粒子內(nèi)裝載藥物阿霉素，進(jìn)行靶向治療[2]。(3)合成靶標(biāo)激活的信號(hào)-配體復(fù)合物。Levi等[3]報(bào)道了一種被基質(zhì)金屬蛋白酶切激活的分子探針(Alexa750-CXeeeeXPLGLAGrrrrrXK-BHQ3)，其包含兩種不同吸光波長(zhǎng)的光吸收劑，BHQ3和Alexa750。其中，BHQ3與細(xì)胞穿透多肽相連，具有細(xì)胞穿透性，而Alexa750與聚谷氨酸鏈相連，不具有細(xì)胞穿透性，二者通過肽序列PLGLAG相連，該肽序列可被基質(zhì)金屬蛋白酶- 2(matrix metalloprotein-ase- 2, MMP- 2)和 MMP- 9切割。BHQ3與Alexa750產(chǎn)生的光聲信號(hào)強(qiáng)度相似，MMP- 2和MMP- 9不存在時(shí)，光聲信號(hào)沉默，MMP- 2和MMP- 9存在時(shí)，復(fù)合物被切割，BHQ3進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，Alexa750則被洗掉，光聲信號(hào)增強(qiáng)。

3 光聲信號(hào)復(fù)合物

3.1 小分子有機(jī)染料

具有近紅外區(qū)吸收光譜(620～950 nm)的有機(jī)小分子染料(約1 nm大小)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物體光聲成像。小分子染料的化學(xué)基礎(chǔ)為高度共軛體系，電子離域化，即從基態(tài)進(jìn)入激發(fā)態(tài)吸收的能量更少，基態(tài)和激發(fā)態(tài)間明確界定的能量間隙使之產(chǎn)生特征性的吸收峰。小分子染料作為光聲造影劑，其優(yōu)點(diǎn)是生物相容性好，毒性低，能快速徹底地從循環(huán)中清除，易于功能化修飾；缺點(diǎn)是摩爾吸光系數(shù)低(<3×105/M·cm)，在血液循環(huán)中的時(shí)間短，不易被運(yùn)送或停留在靶標(biāo)位點(diǎn)上，長(zhǎng)時(shí)間暴露于激光下會(huì)發(fā)生光漂白，光穩(wěn)定性差。但這些缺點(diǎn)可通過化學(xué)修飾來彌補(bǔ)，以降低量子產(chǎn)率，提高光穩(wěn)定性[4]。

常用的小分子染料包括菁染料，偶氮染料(亞甲藍(lán)[5]、伊文氏藍(lán)[6])，Alexa Fluor染料，Atto染料，BHQ3，其中ICG[7- 8]、亞甲藍(lán)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于人體。Sano等[8]用ICG的衍生物ICG-EG4-Sulfo-OSu標(biāo)記EGFR帕尼單克隆抗體(panitumumab，Pan)，合成靶標(biāo)于EGFR的光聲成像探針Pan-EG4-ICG，靜脈注射于荷瘤小鼠(A431細(xì)胞，EGFR++)體內(nèi)，在腫瘤內(nèi)可探及特異性增強(qiáng)的光聲信號(hào)。

3.2 貴金屬納米顆粒

貴金屬納米顆粒的光學(xué)特性源于其局域表面等離子共振(localized surface plasmon resonance, LSPR)效應(yīng)。當(dāng)暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光時(shí)，納米顆粒表面導(dǎo)電電子在陽離子晶格的共振頻率下相互振蕩，振蕩能大部分轉(zhuǎn)換成光聲成像所檢測(cè)的熱能，其摩爾吸光系數(shù)比小分子染料高多個(gè)數(shù)量級(jí)，是NIR范圍內(nèi)最高摩爾吸光系數(shù)的造影劑，具有高光聲轉(zhuǎn)化效率。貴金屬納米顆粒主要包括金和銀納米顆粒，其中金納米顆粒(gold nanoparticles, GNP)被廣泛應(yīng)用于光聲成像。

LSPR的頻率決定GNP的峰值吸收譜，其光學(xué)性質(zhì)可通過改變顆粒的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)(多數(shù)金納米顆粒大小在10～200 nm之間)，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力。該納米顆粒另一重要優(yōu)點(diǎn)是其表面易被化學(xué)修飾，可降低細(xì)胞毒性或增加其在生物體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間和穩(wěn)定性，對(duì)分子靶向研究具有重要意義。

GNP的缺點(diǎn)是長(zhǎng)時(shí)間暴露于激光照射后易發(fā)生形變，影響光聲信號(hào)并導(dǎo)致成像結(jié)果隨時(shí)間延長(zhǎng)而不一致。在合成過程中，GNP存在潛在細(xì)胞毒性，體積較大時(shí)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取后不能完全從體內(nèi)清除，其短期和長(zhǎng)期安全性尚需討論[9- 11]。但這些缺點(diǎn)可通過表面修飾得以改善，例如用二氧化硅涂層包封可降低金與溶劑的界面熱阻，增加納米顆粒的光穩(wěn)定性，提高光聲成像的轉(zhuǎn)化效率并允許其較長(zhǎng)時(shí)間保持原始形狀[12- 14]。而官能團(tuán)如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)或整合素可直接連接到表面以優(yōu)化其生物相容性和穩(wěn)定性。

GNP具有所有光聲信號(hào)復(fù)合物中最靈活的光物理學(xué)性質(zhì)。通過金-硫醇鍵，GNP可附著一系列靶向和用于多模態(tài)成像的信號(hào)化合物。GNP在血管和組織內(nèi)的相互作用取決于其大小、形狀、電荷和合成途徑，因此，需要對(duì)單個(gè)納米顆粒進(jìn)行長(zhǎng)期毒性研究，以更系統(tǒng)地解決體內(nèi)生物相容性問題。

3.3 碳納米材料

碳納米管、石墨烯基納米材料和納米金剛石是碳的同素異形結(jié)構(gòu)[15]，其中廣泛用于光聲成像的碳納米材料是單層納米碳管(single-walled carbon nanotubes,SWNT)，其屬于非等離子體納米顆粒，是不依賴于LSPR效應(yīng)的強(qiáng)光吸收劑[16]。盡管SWNT的摩爾吸光系數(shù)低于GNP，吸收光譜相對(duì)較寬(包括紫外光、可見光、近紅外光和微波)，但由于合成和官能化的靈活性，尤其是可以多種共價(jià)和非共價(jià)修飾，其仍具有作為光聲成像信號(hào)分子的很大潛力。例如可通過表面涂覆薄層金以提高其吸光能力[17]；將染料連接到SWNT，不僅能增加特異性光吸收，還能提高PA轉(zhuǎn)化效率[18]；將靶向配體與SWNT連接可用于腫瘤特異性分子成像[19]等。

碳納米材料的毒性研究值得重視。原始SWNT(即未經(jīng)官能團(tuán)修飾的)的細(xì)胞毒性[20]及腹腔注射或吸入給藥時(shí)對(duì)動(dòng)物的影響[21- 22]已有報(bào)道，但進(jìn)一步研究表明，通過合適的官能化能顯著減少其毒性[23]。碳納米材料的安全性與其表面官能團(tuán)修飾、大小、形狀及合成方法有關(guān)，未來仍需努力，以更好地了解碳納米材料的光物理學(xué)特性和生物相容性。

3.4 有機(jī)納米多聚物

有機(jī)納米多聚物是新型的光聲造影劑，目前研究較多的是聚吡咯(polypyrrole，PPy)和卟啉。PPy是有機(jī)導(dǎo)電聚合物，具有較強(qiáng)NIR吸收、高光熱轉(zhuǎn)化效率和光穩(wěn)定等特性，注射PPy 納米顆粒溶液后，在波長(zhǎng)808 nm激光下對(duì)小鼠大腦皮層成像，能夠獲得清晰的腦血管圖像[24]。卟啉是天然有機(jī)雜環(huán)大分子化合物，可進(jìn)行靈活修飾以調(diào)整光學(xué)特性。在大鼠模型中，皮下注射卟啉脂質(zhì)體可對(duì)淋巴網(wǎng)及前哨淋巴結(jié)顯像[25]。通過卟啉-脂質(zhì)組件，將高濃度卟啉分子引入微泡中，合成三模態(tài)成像微泡，還可在小鼠移植瘤中進(jìn)行超聲、光聲和熒光三模態(tài)成像[26]。

3.5 基因編碼的生色團(tuán)

除了引入外源性的信號(hào)復(fù)合物，還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入外源性報(bào)告基因，如光聲信號(hào)蛋白基因或內(nèi)源性色素酶切基因等，用于光聲成像。

有報(bào)道可使用lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶[27]。局部注射無色的乳糖類似物X-gal后，β-半乳糖苷酶對(duì)該底物進(jìn)行切割，產(chǎn)生穩(wěn)定的深藍(lán)色產(chǎn)物，可吸收光產(chǎn)生光聲信號(hào)。其成像深度可達(dá)約5 cm。但由于X-gal需局部應(yīng)用，且代謝產(chǎn)物清除率差，lacZ報(bào)告基因系統(tǒng)應(yīng)用有限。Filonov等[28]報(bào)道了基于細(xì)菌染色體的近紅外熒光蛋白iRFP，可作為光聲成像探針，在不需要注射外源性底物的情況下在NIR光譜下即可產(chǎn)生比血液更強(qiáng)的光聲信號(hào)，顯示出良好的光穩(wěn)定性。遺傳基因編碼蛋白質(zhì)在動(dòng)物全身成像方面具有巨大潛力，在動(dòng)物模型或人類離體細(xì)胞治療的應(yīng)用上，報(bào)告基因策略提供了潛在的方法。然而，由于需要引入外源性報(bào)告基因，在人體應(yīng)用上仍具挑戰(zhàn)性[16]。

3.6 其他

3.6.1 硫化銅

半導(dǎo)體硫化銅納米顆粒(copper sulfide nanopar-ticles, CuS NPs)也可用于光聲成像。CuS NPs的平均直徑為(11±3)nm，吸收峰在990 nm附近。小鼠顱內(nèi)注射后可觀察大腦，間質(zhì)注射后可觀察皮膚下方12 mm處的淋巴結(jié)，另外將含有CuS NPs的瓊脂糖凝包埋在雞胸肉中成像，可觀察到深約5 cm的光聲信號(hào)[29]。

3.6.2 鐵氧化物

超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)納米顆粒，是由FDA批準(zhǔn)的用于磁共振T2加權(quán)成像的陰性造影劑，其同時(shí)具有等離子體和超順磁性，可用于組合的光聲和磁共振成像。例如將氧化鐵納米顆粒與尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator, uPA)的氨基末端片段連接，用近紅外染料標(biāo)記，合成光聲成像探針NIR830-ATF-IONP，可特異性結(jié)合人乳腺癌中高度表達(dá)的uPA受體。體內(nèi)研究表明，與對(duì)照組相比，靜脈注射探針后的小鼠腫瘤組織中光聲信號(hào)明顯增加[30]。

3.6.3 半導(dǎo)體聚合物納米顆粒

半導(dǎo)體聚合物納米顆粒(semiconducting polymer nanoparticles, SPN)的光學(xué)特性已經(jīng)獲得越來越多的關(guān)注。SPN主要由半導(dǎo)體聚合物(semiconducting polymer, SP)制成，SP具有π電子離域主鏈，由于疏水性聚合物鏈的破壞，導(dǎo)致從有機(jī)溶劑到水溶劑疏水性顯著降低，形成了球形納米顆粒[31]。SPN具有高吸光系數(shù)、高光穩(wěn)定性、光學(xué)性質(zhì)可調(diào)節(jié)和尺寸可控等優(yōu)點(diǎn)[32- 33]。其由生物惰性組分組成，因此規(guī)避了重金屬離子誘導(dǎo)的生物毒性問題，且具有良好的生物相容性[32]。

有研究應(yīng)用聚{2,6-[4,4-雙-(2-乙基己基)-4H-環(huán)戊(2,l-b;3,4-bc)雙噻吩]-交替-4,7-(2,l,3-苯并噻二唑)}[poly(cyclopentadithiophene-alt-benzothiadiazole)，PCPDTBT]進(jìn)行光聲成像，與GNP和SWNT相比，PCPDTBT具有更好的光穩(wěn)定性和更強(qiáng)的PA信號(hào)[34]。SPN體積較小，可溢出血管外，易被腫瘤[35]及淋巴結(jié)[34]攝取，因此具有良好的生物應(yīng)用前景。

4 配體

在光聲信號(hào)分子上連接腫瘤特異性配體，使信號(hào)分子與靶標(biāo)組織結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性成像，按照配體體積和分子量由小到大排列，其主要包括小分子、肽類、親和小體、適體和抗體。小分子的組織穿透力強(qiáng)、生物分布好，體內(nèi)易清除，毒性低，但通常需精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化。肽類易合成，價(jià)格低廉，具有良好的生物分布能力，特異性好，毒性低[1, 19, 36]。親和小體具有高親和性和特異性，穩(wěn)定性好，生物分布好等特性，是良好的配體分子[37]。適體具有高特異性，易合成，價(jià)格低廉，生物分布好，無免疫原性，且其生物分布能力經(jīng)修飾后可優(yōu)化[38]?？贵w及蛋白親和力高且具有特異性，但由于分子量大，組織穿透力弱，不易被清除，且具有免疫原性[8，38]。

5 展望

光聲成像使用非電離輻射方法實(shí)時(shí)成像，具有高空間分辨率和穿透深度，未來發(fā)展前景廣闊，目前的臨床前實(shí)驗(yàn)主要集中于腫瘤檢測(cè)、分期和療效檢測(cè)等方面。盡管近年來有大量關(guān)于光聲成像造影劑的報(bào)道，但外源性造影劑的研究仍處于早期階段。研發(fā)新的光聲成像造影劑，應(yīng)規(guī)范化應(yīng)用其物理和化學(xué)特性，包括基于質(zhì)量和每摩爾的吸光系數(shù)，以及在不同溶劑中的吸收光譜；除了優(yōu)化光學(xué)特性，造影劑還需滿足靶向性和生物相容性的要求。由于生物相容性及毒性與納米顆粒的大小、結(jié)構(gòu)和合成方式密切相關(guān)，每一種納米顆粒均需在細(xì)胞和生物體兩個(gè)水平評(píng)估其毒性、免疫原性、炎癥反應(yīng)及清除能力。目前的研究多使用簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型，如使用免疫缺陷裸鼠和皮下異種移植腫瘤模型，而未來的臨床前研究最終應(yīng)將實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化到具有免疫能力背景的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型上。

距離實(shí)現(xiàn)光聲分子成像的臨床應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走，與所有新藥研發(fā)類似，從研發(fā)到推廣臨床試驗(yàn)和FDA批準(zhǔn)，均需經(jīng)過嚴(yán)格的生物安全評(píng)估和監(jiān)管批準(zhǔn)步驟。期待未來能發(fā)現(xiàn)滿足光物理學(xué)和生物學(xué)要求的造影劑，其對(duì)腫瘤的靶向治療研究具有重大意義。