吳衛(wèi)鋒 蓋曉東

(南京市第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003)

我國是慢性乙型肝炎(乙肝)高感染國家〔1〕，調(diào)查研究顯示，30%～50%的慢性乙肝患者合并肝脂肪變，其中以中老年人群為主〔2〕。目前關于慢性乙肝與肝脂肪變相互關系的研究多集中在流行病學資料，對合并肝脂肪變是否影響慢性乙肝抗病毒應答的結(jié)論尚未一致〔3，4〕。本次研究擬探討合并肝脂肪變對慢性乙肝患者抗病毒療效的影響及可能機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2012年6月至2016年10月在南京市第二醫(yī)院確診為慢性乙肝的中老年患者90例，將其中合并肝脂肪變37例為肝脂肪變組，單純慢性乙肝53例為無肝脂肪變組。入選標準：①乙肝表面抗原(HBsAg)陽性持續(xù)時間>6個月，血清乙肝病毒(HBV)-DNA陽性；②肝組織活檢確診為慢性乙肝但不限制是否合并肝脂肪變；③未接受抗病毒治療。排除標準：①合并其他類型肝炎病毒感染；②存在酒精肝、藥源性肝病、自身免疫性肝病等其他肝臟損傷因素者；③合并糖尿病，肝腎等重要器官功能障礙者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情同意。收集活檢時兩組患者肝組織標本，10%甲醛溶液固定后用于本實驗。

1.2主要試劑 氫氧化銀氨液、硫酸鐵銨溶液購于北京百奧萊博科技有限公司；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購于赫澎(上海)生物科技有限公司；兔抗人乙肝核心抗原(HBcAg)單克隆抗體、兔抗人HBcAg單克隆抗體、生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體購于上海麥倉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織炎癥分級 取固定后的肝組織標本常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片機4 μm連續(xù)切片后置于純水中，干凈的載玻片撈起后放入70℃烘箱中1 h。常規(guī)脫蠟、透明后行HE染色，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察肝組織炎癥分級。

1.3.2氫氧化銀氨液浸染法觀察肝組織纖維化情況 切片脫蠟后，放入酸性高錳酸鉀溶液氧化3 min，蒸餾水沖洗；放入2%硫酸鐵銨溶液10 min，蒸餾水沖洗；向每張切片上滴加氫氧化銀氨溶液反應10 min，蒸餾水沖洗后用20%甲醛溶液還原3 min，脫水、透明、中性樹膠封固。

1.3.3免疫組化檢測HBsAg、HBcAg表達情況 切片脫蠟后用磷酸緩沖液洗滌，每張切片上滴加100 μl過氧化物阻斷劑，室溫下靜置20 min，沖洗后滴加100 μl山羊血清，室溫下靜置20 min，沖洗后滴加兔抗人HBsAg、HBcAg單克隆抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育2 h，滴加生物素標記的羊抗兔IgG抗體(1∶500稀釋)，-4℃冷藏過夜，DAB顯色、蘇木精復染、中性樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較進行t檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組肝活檢前生化、血清、病毒學指標比較 肝脂肪變組谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TB)、直接膽紅素(DB)、高密度脂蛋白(HDL)、載脂蛋白(Apo)a水平明顯低于無肝脂肪變組(P<0.05)；肝脂肪變組低密度脂蛋白(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Apob、尿酸(UA)水平明顯高于無肝脂肪變組(P<0.05)；兩組白蛋白(ALB)、空腹血糖(FBG)、HBV-DNA載量、乙肝e抗原(HBeAg)陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組肝活檢前生化、血清、病毒學指標比較

2.2兩組炎癥和纖維化程度比較 肝脂肪變組炎癥和纖維化程度明顯低于無肝脂肪變組，中重度以上炎癥和纖維化程度比例明顯低于無肝脂肪變組(P<0.01)。見表2，圖1，圖2。

2.3兩組HBsAg、HBcAg表達強度和面積比較 HBsAg多表達于胞質(zhì)、漿膜內(nèi)，分為漿膜型、胞質(zhì)型，部分伴有包涵體型，單純胞膜上表達較少；HBcAg表達包括陰性、胞質(zhì)型、胞核型、漿核型，以漿核型為主(見圖3)。將陽性細胞表達強度和面積均分別合并為1～2級(+～)、3～4級(～)以方便統(tǒng)計比較。結(jié)果顯示，肝脂肪變組HBsAg、HBcAg表達強度3～4級及表達面積3～4級的比例均明顯低于無肝脂肪變組(P<0.01)。見表3，圖3。

表2 兩組炎癥和纖維化程度比較〔n(%)〕

表3 兩組HBsAg、HBcAg表達強度和面積比較〔n(%)〕

與無肝脂肪變組比較：1)P<0.01

A：炎癥輕微，匯管區(qū)可見少量浸潤及分散的小泡性脂肪細胞；B：界面炎癥，匯管區(qū)可見炎性浸潤；C：肝細胞氣球樣病變，匯管區(qū)可見大量炎性浸潤；D：肝細胞壞死，匯管區(qū)大量炎性浸潤圖1 兩組不同炎癥程度炎癥細胞浸潤情況(HE，×100)

A：匯管區(qū)纖維沉積，血竇周圍少量纖維化；B：匯管區(qū)和血竇輕微纖維化；C：匯管區(qū)芒狀纖維沉積，血竇周圍少量膠原纖維沉積；D：匯管區(qū)少量芒狀纖維沉積圖2 兩組不同纖維化程度(氫氧化銀氨液浸染法染色，×100)

A：HBsAg在肝脂肪變組細胞中漿膜型表達(×200)；B：HBcAg在肝脂肪變組細胞中漿核型表達(×200)；C：無肝脂肪變組HBsAg反應強于肝脂肪變組(×100)；D：肝脂肪變組HBcAg反應強度和面積下降(×100)圖3 免疫組化檢測HBsAg、HBcAg在肝組織中的表達情況

3 討 論

相關研究顯示，慢性乙肝合并肝脂肪變患者干擾素治療的效果偏低〔5〕，但影響機制尚未明確。有研究者認為，該影響可能與肝細胞中脂肪堆積影響了正常細胞形態(tài)，造成干擾素與細胞膜接觸面積減少有關〔6〕。本次研究提示慢性乙肝患者出現(xiàn)肝脂肪變主要與宿主代謝異常有關，而且合并肝脂肪變患者肝損傷程度低于未合并者。

HBsAg、HBcAg在肝組織中表達與肝細胞損害程度密切相關〔7〕。本次研究中無論慢性乙肝患者是否合并肝脂肪變，肝細胞中HBsAg、HBcAg均主要分布于漿膜、漿核中，兩組抗病毒蛋白在肝細胞中的分布情況無明顯差異，提示肝脂肪細胞不影響乙肝病毒蛋白在肝組織中的分布位置。但HBsAg、HBcAg的表達強度和面積受脂肪細胞影響，提示脂肪的存在能夠減弱乙肝病毒蛋白在肝細胞中的表達。相關研究顯示，HBV進入人體血液循環(huán)后最先感染肝細胞，在胞質(zhì)中分泌HBsAg、HBcAg等病毒抗原，當累積到一定數(shù)量后可誘發(fā)特異性免疫應答，攻擊被感染的肝細胞〔8〕。因此可推測，在是否合并肝脂肪變抗原表達方式無明顯差異的前提下，合并肝脂肪變可明顯減弱HBsAg、HBcAg在肝細胞中的表達水平，同時減弱了病毒蛋白激活免疫應答的能力，進而減少了肝細胞被攻擊程度，在炎癥反應較輕的同時也減弱了干擾素的抗病毒療效。今后的研究中可從免疫水平和病毒DNA水平進一步驗證以上觀點。

1孫 云.2015年3月-2016年3月臨滄市乙型病毒性肝炎流行特征及防控進展〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2017；16(1)：91-2.

2趙 帥，孫靜娜，代麗麗，等.老年慢性乙型肝炎患者用藥治療后乙肝病毒耐藥基因多位點變異〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(10)：2484-5.

3張 琨.慢性HBV感染者外周血單個核細胞凋亡相關因子的表達和乙肝慢性化關系〔D〕.濟南：山東大學，2016.

4劉 瑩.乙肝轉(zhuǎn)陰散在恩替卡韋分散片治療乙型肝炎肝硬化過程中的作用及其機制研究〔D〕.南寧：廣西中醫(yī)藥大學，2016.

5倪紅霞，劉楠楠，姜 晶，等.慢性肝病肝穿活檢組織病理學研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2017；18(2)：197-200.

6喻慧銘，盛吉芳.e 抗原陰性慢性乙肝老年患者核苷類藥物停藥后的臨床和病毒學復發(fā)評估〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(6)：1393-5.

7邊瑞巖.2005～2014年濱州市乙型病毒性肝炎流行特征分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2016；15(3)：275-6.

8郝 銳.恩替卡韋治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床觀察〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；(5)：630-2.