吳麗麗 周 蓓 陳 豪 馮麗婷 何金桂

蛤蚧(GekkogeckoLinnaeus)為脊索動物門爬行綱壁虎科動物，又名蛤蟹、仙蟾、蚧蛇、大壁虎、德多等，首載于《雷公炮炙論》，《本草綱目》記載：蛤蚧咸性平、歸肺、腎經(jīng)，具有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效，用于虛喘氣促、勞嗽咳血、陽痿遺精。蛤蚧具有多方面的藥理作用，而現(xiàn)代研究多以對其原藥材的醇提物進行分析，如林安平等[1]研究表明蛤蚧乙醇提取液能顯著提高IGF-1和Inh A在大鼠卵巢中的表達，從而改善大鼠卵巢功能。張勝昌等[2]研究表明蛤蚧乙醇提取液可能誘導骨微環(huán)境中TGF-β1表達增加，有效預防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生。此外，多項研究表明[3～6]，蛤蚧對環(huán)磷酰胺誘導免疫功能低下小鼠、荷瘤小鼠具有抑瘤、提高免疫等作用。但鮮少見有關(guān)于蛤蚧對衰老模型小鼠免疫功能影響的報道，因此本實驗通過觀察蛤蚧乙醇提取液以及仿生酶解液對D-半乳糖(D-gal)誘導衰老小鼠免疫功能的影響，以期為進一步研究蛤蚧增強機體免疫、延緩衰老提供依據(jù)。

1.材料

1.1 藥材 蛤蚧干燥體，購買于玉林藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室田慧教授鑒定其為壁虎科動物蛤蚧(Gekko gecko Linnaeus)。清理蛤蚧表面灰塵，去掉頭部，置干燥箱內(nèi)60℃烘干后，用粉碎機進行粉碎，使全部蛤蚧粉末能通過二號篩，混合均勻，備用。

1.2 動物 清潔級2～3月齡昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK桂2016-0504。實驗小鼠進入動物房適應3天后開始實驗。動物飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF實驗動物級環(huán)境設施標準，實驗室按晝夜節(jié)律采光12小時，通風良好，室溫保持在20℃～25℃左右，定期消毒。

1.3 儀器 中草藥粉碎機(型號：LD-500，天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱真空干燥箱(型號：DZF-6000系列，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；超聲波清洗器(型號：KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；精密電子天平(型號：SQP，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(型號：DKS-26，上海精宏實驗設備有限公司)；離心機(型號：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠)；微孔板檢測儀(型號：Infinite M200 PRO，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.4 試劑 D-半乳糖(Sigma公司，批號：G6404)，胃蛋白酶(1:3000，Amresco公司，批號0685)，胰蛋白酶(1:250，Amresco公司，批號：B0016K040100)，維生素E軟膠囊[國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司，批號：10853003]，IL-2試劑盒(Bio-Swamp公司，批號：201606)，其余所用化學試劑、藥品均為分析純，水為超純水。

2.方法

2.1 藥液的制備 ①蛤蚧乙醇提取液：精密稱取蛤蚧粉末40.5g，加入20%乙醇溶劑1000ml，置于超聲波清洗器中，超聲溫度為35℃，超聲60分鐘后過濾上清液，殘渣再加相同體積的溶劑進行超聲，合并所得上清液，然后濃縮至65ml，即為蛤蚧乙醇提取液。②蛤蚧仿生酶解液[7]：精密稱取蛤蚧粉末40.5g，放入1000ml燒杯中，加入1000ml的蒸餾水，在40℃下水浴提取15分鐘，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0，在37℃下水浴保溫10分鐘后加入1%胃蛋白酶，在37℃下酶解2小時，然后加熱到65℃將酶滅活；然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為8.0，在50℃下水浴保溫10分鐘后加入1%胰蛋白酶，在50℃下酶解3小時，然后加熱到65℃將酶滅活。在酶解液冷卻至室溫后，過濾，濃縮至65ml，即為蛤蚧仿生酶解液。③維生素E：取維生素E 50mg，溶于10ml食用油中制成濃度為5mg/ml的溶液，備用。

2.2 分組與給藥 將50只小鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、維生素E組、乙醇提取液組、仿生酶解液組，共5組，每組10只。正常對照組按0.1ml/10g頸背部皮下注射0.9%生理鹽水，其余各組小鼠按120mg/kg、給藥劑量0.1ml/10g頸背部皮下注射D-gal，每日1次，連續(xù)注射6周。造模后，正常對照組和模型對照組灌胃等體積0.9%生理鹽水，維生素E組、乙醇提取液組和仿生酶解液組按0.1ml/10g分別灌胃對應藥液，連續(xù)給藥21天。實驗期間小鼠自由進食、進水，每3天稱重1次，按體重調(diào)整給藥劑量。

3.檢測指標及檢測方法

3.1 小鼠脾臟和胸腺指數(shù)測定 摘眼球取血前，準確稱定各組小鼠的體重，摘取眼球取血后頸部脫臼處死，摘除脾臟和胸腺，用預冷的生理鹽水反復沖洗，用濾紙吸干，用電子天平稱其重量，計算各臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體重(g)。

3.2 檢測小鼠血清中細胞因子IL-2濃度 取血后，自然靜置30分鐘，然后以3000r/min離心10分鐘，取上清液即為血清，再按ELISA試劑盒說明書操作，測定血清中細胞因子IL-2的濃度。

4.結(jié)果

4.1 小鼠一般行為學觀察 實驗期間每天觀察小鼠一般行為改變，包括進食、活動、毛色改變等情況，并每隔3天稱小鼠體重1次，觀察各組小鼠體重變化情況。連續(xù)皮下注射D-gal 6周，小鼠毛色逐漸枯槁沒光澤，皮膚彈性變差，精神萎靡，活動減少，倦怠嗜睡，進食減少，飲水量下降，體重減輕，呈現(xiàn)出衰老體征。如表1可知，各組小鼠初始體重無明顯差異(P>0.05)；連續(xù)皮下注射D-半乳糖6周后，與正常對照組相比，其余各組小鼠的末次體重和增重均顯著降低(P<0.05)。

4.2 蛤蚧不同提取液對D-gal誘導衰老小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表2，與正常對照組比較，模型對照組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，維生素E組、乙醇提取液組、仿生酶解液組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，而各給藥組之間無明顯差異(P>0.05)。

表1 D-gal誘導衰老小鼠體重變化(n=10)

注：與正常對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

表2 各組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較

注：與正常對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型對照組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

4.3 蛤蚧不同提取液對D-gal誘導衰老小鼠細胞因子IL-2的影響 結(jié)果見表3，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清中IL-2水平顯著下降(P<0.01)；與模型對照組比較，維生素E組和仿生酶解液組小鼠血清中IL-2水平均升高，并具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但兩組之間無顯著性差異(P>0.05)；乙醇提取液組血清中IL-2水平有一定程度的提高，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠血清細胞因子IL-2的水平(n=10)

注：與正常對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型對照組比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

5.討論

免疫衰老學說作為衰老機制的經(jīng)典學說之一，認為免疫系統(tǒng)是衰老過程的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，最初在于增齡導致的胸腺萎縮，進一步導致機體細胞免疫、體液免疫以及天然免疫發(fā)生不同程度的改變[8]。胸腺作為機體的中樞免疫器官，是各種T細胞分化成熟的場所，其功能狀態(tài)的正常與否，直接關(guān)系到到機體整體免疫情況的好壞。而脾臟作為人體最大的外周免疫器官，有大量的淋巴樣組織產(chǎn)生淋巴細胞和單核細胞，其次脾臟還是機體的“血庫”，能儲存體內(nèi)的血液以及發(fā)揮濾血的作用，主要是脾內(nèi)有許多吞噬細胞能夠清除經(jīng)過脾內(nèi)血液中的衰老血紅細胞，從而參與機體免疫機制。IL-2是一種在機體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要而復雜作用的細胞因子，既可促進淋巴細胞增殖，增強免疫功能，又能限制T細胞反應而增強機體的免疫耐受，故可用于治療腫瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病[9]。因此通過測定小鼠胸腺指數(shù)、脾腺指數(shù)和IL-2來指示小鼠的免疫功能。

D-半乳糖誘導衰老模型由于其操作簡便、造模時間較短、模型易于建立、重復性好等優(yōu)勢，且表現(xiàn)出與自然衰老動物相似的衰老體征，已成為國內(nèi)較公認的衰老模型。曹湘博等[10]研究表明，給小鼠皮下注射D-半乳糖40mg/(kg·d)，連續(xù)給藥10天，其胸腺指數(shù)、T細胞增殖活性以及IL-2，IFN-γ，TNF三種TH1型細胞因子活性均明顯低于正常對照組，表明D-半乳糖可誘導小鼠免疫功能降低。董會萍[11]對D-半乳糖誘導衰老小鼠的劑量進行篩選實驗，結(jié)果表明，在120～150mg/(kg·d)劑量范圍，D-半乳糖能夠引起抗氧化酶系統(tǒng)活力的下降，同時造成實驗動物空間認知能力的損傷，而低劑量75mg/(kg·d)作用不明顯。此外，高劑量條件[1000mg/(kg·d)]雖然也能夠引起上述生理、生化和行為改變，但是在該劑量條件下，實驗動物免疫力明顯下降，死亡率較高，且自主活動減少，不利于認知、情緒相關(guān)的行為學實驗的進行及結(jié)果的判定，因此選擇120～150mg/(kg·d)作為建立D-半乳糖衰老動物模型的合理劑量范圍。

中醫(yī)認為，腎為先天之本，藏先天之精，主生殖，為人體生命之本原。腎陽為一身陽氣之本，能推動和激發(fā)臟腑的各種機能，溫煦全身臟腑形體官竅。因此，認為蛤蚧可通過補腎、助陽益精的功效達到延緩機體衰老的目的。羅謀倫等[12]研究表明蛤蚧乙醇提取物可延長雌雄果蠅的平均壽命及半數(shù)死亡時間，提高雌雄果蠅飛翔活力及耐寒力，延長小鼠的缺氧存活時間，證實蛤蚧具有一定的抗衰老作用。薛長江等[13]研究表明蛤蚧醇提液能顯著提高18月齡衰老大鼠心肌組織自由基清除能力達到延緩衰老的作用。

現(xiàn)代研究認為，蛤蚧具有抗炎、平喘、抗應激、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等方面的作用主要與蛤蚧體內(nèi)含有大量的功能蛋白密切相關(guān)。而隨著現(xiàn)今對蛋白質(zhì)類藥物的研究，多集中在將大分子蛋白質(zhì)變成分子量較小的多肽，從而尋找活性中心，以達到更好的藥效。而仿生酶解法是先通過胃蛋白酶酶解，再經(jīng)過胰蛋白酶酶解，模擬人體消化過程，可使蛤蚧中的蛋白質(zhì)類成分酶解成小分子肽，能提高蛤蚧中物質(zhì)基礎的溶出率。因此，本試驗比較研究乙醇提取和仿生酶解蛤蚧對D-半乳糖誘導衰老小鼠免疫功能的影響。實驗結(jié)果表明，蛤蚧的仿生酶解液和乙醇提取液均能提高D-半乳糖誘導衰老小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)以及血清中IL-2水平，且仿生酶解液增強免疫作用優(yōu)于乙醇提取液，提示蛤蚧通過仿生酶解法提取，可有效提高蛤蚧多肽溶解率，進而顯著增強機體免疫功能，為進一步研究蛤蚧延緩衰老的機制提供借鑒。

1 林安平，胡麗娜，李聰.蛤蚧乙醇提取液對大鼠卵巢顆粒細胞影響的實驗研究[J].兒科藥學雜志，2007，13(3)：13-15,21.

2 張勝昌，白鷺，藍玲，等.蛤蚧乙醇提取液影響去勢大鼠脛骨TGF-β1表達的研究[J].廣西醫(yī)科大學學報，2010，27(2)：191-194.

3 席瑋，謝裕安，楊帆，等.蛤蚧肽對荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[J].內(nèi)科，2011，6(1)：5-8.

4 楊帆，席偉，謝裕安，等.蛤蚧肽對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].廣西醫(yī)科大學學報，2011，28(3)：342-344.

5 周蓓，陳豪，吳麗麗，等.蛤蚧對S(180)荷瘤小鼠Th1/Th2免疫細胞平衡的影響[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12(9)：11-13.

6 蛤蚧對S180荷肉瘤小鼠的抑瘤作用及對免疫系統(tǒng)的影響[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報，2005，39(5)：402-404.

7 李欽青，孫明江，代龍，等.壁虎不同提取工藝成分抗腫瘤作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(7)：1629-1630.

8 史進方，顧國浩，張學光.免疫衰老及其免疫學預警指標[J].現(xiàn)代免疫學，2005，25(4)：347-349.

9 常瑞雪，顏天華，王秋娟，等.白細胞介素-2及其相關(guān)藥物的應用研究進展[J].藥學進展，2011，35(1)：1-7.

10 曹湘博，于樂洋，常雅萍.D-半乳糖亞急性中毒擬衰老模型鼠免疫功能及生化指標變化的研究[J].中國比較醫(yī)學雜志，2007，17(7)：382-385.

11 董會萍.D-半乳糖衰老模型建立及模型小鼠認知功能障礙的研究[D].大連理工大學，2008.

12 羅謀倫，謝干瓊，趙一.蛤蚧抗衰老作用的實驗研究[C].全國抗衰老藥物學術(shù)年會資料匯編，1990：98-103頁.

13 薛長江，周小棉，陳國千，等.蛤蚧對大鼠心肌抗衰老作用的影響[J].中藥藥理與臨床，1992，8(2)：21-24.