許有忠，田 作春，李才

（海南省第三人民醫(yī)院 心胸外科，海南 三亞 572000）

非 小 細 胞 肺 癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是癌癥死亡的主要原因之一[1]。由于早期診斷率低，只有大約20%的病例能夠在早期進行有效的手術(shù)切除[2]。此外，非小細胞肺癌復發(fā)率高，約50%的患者手術(shù)后會發(fā)生遠處復發(fā)。因此，尋找特異性和敏感性均較高的腫瘤標志物，并與多種篩查方法相結(jié)合有望提高對非小細胞肺癌的早期診斷。微小RNA（microRNA）在腫瘤組織中性質(zhì)穩(wěn)定、功能廣泛[3]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-204（miR-204）在子宮內(nèi)膜樣腺癌[4]、鼻咽癌[5]等腫瘤組織中表達降低，并與臨床病理特征及預后相關(guān)；且上調(diào)腫瘤細胞中miR-204，可以抑制細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡、抑制遷移、增加對化療藥物的敏感性。在膽管癌的研究中發(fā)現(xiàn)，將miR-204模擬物導入膽管癌細胞系后能夠負向調(diào)控Bcl-2的表達，且能夠促進化療藥物氟尿嘧啶激發(fā)的細胞凋亡[6]。但miR-204在非小細胞肺癌中的作用尚不十分明確。本研究通過對NSCLC患者病變組織中miR-204的表達進行檢測，以便了解miR-204在非小細胞肺癌中的臨床意義，并對miR-204影響癌細胞增殖和凋亡的機制進行初步探究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇海南省第三人民醫(yī)院收治的NSCLC患者60例，其中,男性34例，女性26例；年齡42～77歲、平均（56.4±7.9）歲。分別取其肺癌組織及對應的癌旁組織，手術(shù)切除標本立即放入液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時收集患者臨床病理特征資料。所有病例術(shù)前均尚未接受化療或放療。所有樣本均經(jīng)研究對象同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

人非小細胞肺癌A-549細胞株購自上海中國科學院細胞庫，F(xiàn)12K培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國Gibco公司，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司，RNA提取試劑盒購自美國Omega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒等均購自大連寶生物工程有限公司。miR-204模擬物、miR-204抑制物及miR-204和內(nèi)參U6的引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設計合成，兔抗人Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling Tech nology公司，HRP標記的羊抗兔二抗、兔抗人b-actin購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司，BCA試劑盒購自廣州碧云天有限公司。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及細胞增殖實驗

非小細胞肺癌A-549細胞株培養(yǎng)在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中，細胞培養(yǎng)液為F12K培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）。轉(zhuǎn)染分為4組：對照組、陰性對照組、miR-204模擬物組、miR-204抑制物組。按說明書將各組轉(zhuǎn)染物與脂質(zhì)體2000混合靜止后轉(zhuǎn)染A-549細胞。另取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞以100μl/孔（約含1×104個細胞）接種于96孔板中，每組設6個平行孔，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48和72 h后，各孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，酶標儀（CliniBiog酶標儀）在450 nm 波長測定各孔吸光度（OD值），以OD值代表細胞相對增殖水平。實驗重復3次。

1.4 細胞凋亡情況檢測

4組細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，分別取1×105個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500μl結(jié)合液重懸細胞。隨后加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻，室溫避光孵育15 min。采用流式細胞儀（BD FACSCzlibur）檢測細胞凋亡情況，計算凋亡率。實驗重復3次。

1.5 肺癌組織和細胞中總RNA提取及qRT-PCR檢測

凍存肺癌組織及其對應癌旁組織各取約100 mg×6份、4組轉(zhuǎn)染后的A-549細胞各收集約1×107個細胞，分別加入1 ml Trizol，用總RNA試劑盒提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計對提取的總RNA檢測純度及定量。將總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；取cDNA采用ABI 7500熒光定量PCR儀進行qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法表示相對表達量。

1.6 Western blot檢測

各組轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集各組的細胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整每孔上樣量，將蛋白樣品在10% SDS-PAGE膠中進行電泳（Bio-Rad SDS-PAGE電泳儀），電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，TBS-T洗膜后分別加入Bcl-2（1︰1 000稀釋）、β-actin（1︰300稀釋）一抗，4℃冰箱孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入二抗（1︰5 000稀釋）室溫孵育1 h，加發(fā)光液進行化學發(fā)光顯影，凝膠成像儀（JS-300凝膠圖像分析儀）拍照。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較為HSD-q檢驗，多時點的比較采用重復測量設計的方差分析，不同組織的mRNA表達水平的比較為配對t檢驗，miR-204相對表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-204的mRNA表達水平及其與各臨床特征參數(shù)的關(guān)系

與對應癌旁組織比較，肺癌組織中miR-204 的mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表2）。人為界定肺癌組織中miR-204 的mRNA相對表達量＜2.41為低表達，≥2.41為高表達。再按基線指標或臨床病理特征的不同水平進行比較，結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-204低表達與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)（P＜0.05）（見表 3）。

2.2 miR-204對A-549細胞增殖和凋亡的影響

miR-204對人A-549細胞增殖和凋亡影響資料的比較 ，采用重復測量設計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間的細胞增殖相對量差異有統(tǒng)計學意義（F=416.149，P=0.000）。②4組細胞增殖相對量的整體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=136.071，P=0.000）。③4組的細胞增殖相對量的變化趨勢差異有統(tǒng)計學意義（F=35.666，P=0.000）。見表 4。

表2 肺癌組織及其對應癌旁組織中miR-204的mRNA表達水平 （n =6，±s）

表2 肺癌組織及其對應癌旁組織中miR-204的mRNA表達水平 （n =6，±s）

組別 mRNA（2-ΔΔCt） t值 P值肺癌組織 2.41±0.91 9.361 0.000癌旁組織 5.62±1.08

表3 miR-204相對表達與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表4 miR-204對人A-549細胞增殖和凋亡的影響比較 （n =6，±s）

表4 miR-204對人A-549細胞增殖和凋亡的影響比較 （n =6，±s）

細胞增殖凋亡率/%24 h 48 h 72 h對照組 2.31±0.03 0.92±0.02 1.05±0.11 1.32±0.12t 14.71±1.10陰性對照組 2.20±0.05 0.82±0.03 0.94±0.05 1.25±0.05 17.28±0.90抑制物組 1.01±0.03 0.87±0.03 1.38±0.11 1.52±0.04 12.08±0.70模擬物組 4.03±0.08 0.62±0.02 0.69±0.02 0.80±0.02 21.90±1.20組別 相對量

經(jīng)qRT-PCR檢測A-549細胞轉(zhuǎn)染miR-204效果。與陰性對 照組相比，miR-204模擬物組的A-549細胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而miR-204抑制物組細胞增殖水平則略有增高。miR-204模擬物組細胞凋亡率較陰性對照組升高，而miR-204抑制物組細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此結(jié)果提示miR-204表達水平可能與A-549細胞增殖及凋亡密切相關(guān)。miR-204對A-549細胞增值和凋亡影響見圖1、2。

2.3 miR-204對A-549細胞Bcl-2表達的影響

為了進一步探討miR-204影響A-549細胞增殖及凋亡的機制，本研究檢測了轉(zhuǎn)染miR-204模擬物后A-549細胞中Bcl-2的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的A-549細胞中Bcl-2的mRNA和蛋白水平均降低，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物的細胞中Bcl-2的mRNA和蛋白水平則增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示了miR-204可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達水平來影響癌細胞的增殖及凋亡。見表5、圖3。

圖1 miR-204對A-549細胞增殖和凋亡的影響

圖2 miR-204對A-549細胞凋亡的影響

圖3 各組轉(zhuǎn)染細胞中Bcl-2蛋白表達水平

表5 miR-204對A-549細胞Bcl-2表達水平的影響 （n =6，±s）

表5 miR-204對A-549細胞Bcl-2表達水平的影響 （n =6，±s）

組別 Bcl-2水平 F值 P值對照組 0.98±0.07陰性對照組 0.92±0.04抑制物組 1.40±0.08模擬物組 0.48±0.02 255.042 0.000

3 討論

盡管非小細胞肺癌的發(fā)病機制在蛋白及基因水平得到深入認識，手術(shù)、放化療等為主的綜合治療有了長足的發(fā)展，但非小細胞肺癌的早期診斷和預后并沒有明顯進展。miRNAs是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，在細胞生物學中發(fā)揮重要作用。最近，研究證明NSCLC中miRNAs的表達與其預后有關(guān)[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中，腫瘤細胞高表達miRNA-21提示預后較好。在非小細胞肺癌組織中有多種miRNAs表達上調(diào)或下調(diào)，可作為非小細胞肺癌的癌基因或抑癌基因，在非小細胞肺癌分化、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[9]。

近年來，研究表明miR-204可能成為一種新的致癌基因或抑癌基因[10-11]。在前列腺癌中，miR-204發(fā)揮癌基因的作用，miR-204的高表達能導致前列腺衍生上皮因子（prostate-derived epithelial factor，PDEF）的丟失從而促使前列腺癌發(fā)生[12]。而在頭頸部鱗狀上皮細胞癌細胞株中過表達的miR-204，通過抑制腫瘤相關(guān)靶基因的表達，并在體外抑制腫瘤的黏附、遷移和侵襲，減少了實驗性肺轉(zhuǎn)移的程度，發(fā)揮抑癌基因的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織中miR-204相對表達量低于癌旁組織，并且在細胞增殖實驗中，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的A-549細胞增殖水平受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物細胞增殖水平則略有增高。實驗結(jié)果提示 miR-204可能作為一種抑癌基因通過抑制癌細胞的增殖來參與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

Bcl-2是細胞凋亡調(diào)控因子，作為一種原癌基因能廣泛抑制細胞凋亡，從而有利于腫瘤細胞的生長[14-16]。CHEN等[6]將miR-204模擬物導入膽管癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)外源性miR-204具有負向調(diào)控Bcl-2的作用，且有利于化療藥物氟尿嘧啶激發(fā)的細胞凋亡。在本研究細胞增殖實驗中，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的細胞增殖水平受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物細胞增殖水平則略有增高。流式檢測轉(zhuǎn)染后細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)模擬物組細胞凋亡率較陰性對照組升高，而抑制物組細胞凋亡率降低。為進一步探討miR-204影響肺癌細胞增殖及凋亡的可能機制，本研究檢測了轉(zhuǎn)染miR-204肺癌細胞中Bcl-2的表達情況，結(jié)果表明，高表達miR-204后，肺癌細胞中Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平均降低，抑制miR-204后細胞中Bcl-2的表達水平則升高，提示miR-204影響肺癌細胞增殖及凋亡的作用可能通過調(diào)控Bcl-2的表達而發(fā)揮效應。

綜上所述，miR-204在非小細胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展過程中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)靶基因Bcl-2影響細胞增殖及凋亡而實現(xiàn)的。

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