馮馨園, 張 婷, 崔 戈, 王旗春, 錢 乙, 蔡 瑩, 仰舒靜, 張夢熒, 姚嘉誠

1)湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理教研室 浙江湖州 313000 2)湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科 浙江湖州 313000

大麻素受體互作蛋白1(cannabinoid receptor interacting protein 1, CNRIP1)是大麻素受體的負(fù)性調(diào)控因子[1]，參與調(diào)節(jié)眼及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等[2-3]。近年來研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，CNRIP1基因啟動(dòng)子區(qū)在結(jié)直腸腺癌組織存在較高程度的甲基化，但目前關(guān)于CNRIP1基因及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究采用5-氮雜胞苷(5-azacytidine, 5-azaC)干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620以降低CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)區(qū)甲基化水平，觀察CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化對結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶[己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)、M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase，PKM2)、乳酸脫氫酶-A(LDH-A)]以及細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑及儀器結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心(ATCC，CCL227)。低糖-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶液購自美國Gibco 公司，5-azaC、亞硫酸氫鹽修飾試劑盒購自德國QIAGEN公司，DNA提取試劑盒購自上海朝瑞生物科技有限公司，Trizol 購自日本TaKaRa公司，T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司，RT-PCR試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國DBI公司，DEPC購自美國Sigma公司，RNasin 購自美國Promega公司，蛋白膠回收試劑盒購自美國OmegaBio-Tek公司，兔抗人CNRIP1、GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(多克隆二抗)購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL試劑盒購自美國Millipore 公司，乳酸測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，CCK-8比色法試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Transwell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國康寧公司，光學(xué)倒置顯微鏡為德國蔡司公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀為美國Agilent公司產(chǎn)品，生化分析儀為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)分組復(fù)蘇SW620，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下用低糖-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；2.5 g/L胰蛋白酶液消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。將細(xì)胞分為干預(yù)組及未干預(yù)組，每組接種3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)組采用5 μmol/L的5-azaC干預(yù)，未干預(yù)組加入等量培養(yǎng)液，處理48 h后做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3亞硫酸鹽測序法檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞中CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平收集2組細(xì)胞，使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，定量后進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。CNRIP1(177 bp)上游引物序列：5’-GCATCCAGCCTAATGACGG-3’，下游引物序列：5’-TCAGTTCCAGTGGGACAAGC-3’，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。用TaKaRa TaqTMHot Start Version進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min。采用蛋白膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接克隆載體(T載體)，挑選5個(gè)陽性克隆PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司測序。采用BiQ Analyzer軟件分析位點(diǎn)甲基化水平。

1.4qRT-PCR檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞中CNRIP1及糖酵解途徑關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)水平收集2組細(xì)胞，充分裂解后離心取上清，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)合成PCR引物，以GAPDH作為內(nèi)參照，相關(guān)引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件按照試劑盒要求操作。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照，分析數(shù)據(jù)。按2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.5Westernblot檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞中CNRIP1及糖酵解途徑關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)水平收集2組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford法檢測濃度。取50 μg總蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(CNRIP1稀釋比例12 000，HK2稀釋比例1800，PKM2稀釋比例13 000，LDH-A稀釋比例12 000，GAPDH稀釋比例12 000)，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，膜接觸過夜。洗膜，加入二抗，稀釋比例120 000，室溫孵育40 min，洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑顯影，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Image-Pro Plus 6.0)分析條帶凈光密度值。以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6生化法檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸含量離心取2組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按乳酸測定試劑盒說明書步驟加入樣本、酶工作液、色劑，渦旋混勻，37 ℃孵育10 min，加入終止劑終止反應(yīng)，采用自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行比色分析，檢測波長為530 nm，比色杯光徑為1 cm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7CCK-8比色法檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性將1.2所述2組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，分別孵育0、24、48、72、96 h；然后每孔加入10 μL CCK-8檢測工作液繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8Transwell法檢測2組結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力

將1.2所述2組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育96 h，收集細(xì)胞，接種于Transwell插入式培養(yǎng)板上室；下室加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液；上下室之間為聚碳酸酯微孔濾膜(孔徑8 μm)。培養(yǎng)18 h除去未黏附細(xì)胞，固定染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜下側(cè)貼壁細(xì)胞，200倍光鏡下選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組細(xì)胞CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、CNRIP1和糖酵解途徑關(guān)鍵酶mRNA及蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活性和遷移細(xì)胞數(shù)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的比較未干預(yù)組結(jié)腸癌細(xì)胞CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)第2216(75%)、2226(100%)、2231(100%)、2245(100%)、2254(100%)、2273(100%)、2286(100%)、2325(100%)位點(diǎn)平均甲基化程度為(96.88±8.84)%；

干預(yù)組結(jié)腸癌細(xì)胞CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)第2216(60%)、2226(60%)、2231(60%)、2245(40%)、2254(40%)、2273(40%)、2286(40%)、2325(40%)位點(diǎn)平均甲基化程度為(47.50±10.35)%。與未干預(yù)組相比，干預(yù)組這8個(gè)位點(diǎn)的平均甲基化水平降低(t=8.428,P<0.001)。

2.2 2組CNRIP1mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較

與未干預(yù)組相比，干預(yù)組CNRIP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高(圖1、表2)。

1：未干預(yù)組；2：干預(yù)組圖1 2組結(jié)腸癌細(xì)胞CNRIP1 蛋白的表達(dá)水平

組別nmRNA蛋白未干預(yù)組31．000±0．0380．329±0．020干預(yù)組32．720±0．3310．899±0．050t9．89180．429P0．0100．008

2.3 2組糖酵解途徑關(guān)鍵酶mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較與未干預(yù)組相比，干預(yù)組SW620細(xì)胞HK2、PKM2、LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低(圖2，表3、4)。

1：未干預(yù)組；2：干預(yù)組圖2 2組結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)水平

組別nHK2PKM2LDH?A未干預(yù)組31．000±0．0201．000±0．0301．000±0．050干預(yù)組30．760±0．0400．660±0．0400．710±0．060t110．21926．9018．547P<0．0010．0010．013

表4 2組結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解途徑關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)水平比較

2.4 2組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸水平的比較與未干預(yù)組[(5.21±0.42) mmol/L)]相比，干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸含量[(2.54±0.23) mmol/L]降低(t=24.034,P=0.002)。

2.5 2組細(xì)胞增殖和遷移能力的比較與未干預(yù)細(xì)胞相比，干預(yù)組SW620細(xì)胞增殖及遷移能力均減弱(圖3、4，表5)。

A：未干預(yù)組；B：干預(yù)組圖3 2組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖曲線

A：未干預(yù)組；B：干預(yù)組圖4 2組結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移數(shù)量

組別n細(xì)胞增殖活性?遷移細(xì)胞數(shù)未干預(yù)組31．443±0．02154．33±17．48干預(yù)組30．792±0．0579．83±9．50t25．8128．178P0．001<0．001

*：以吸光度值表示

3 討論

DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。抑癌基因與修復(fù)基因的高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因沉默與修復(fù)基因失活，造成腫瘤抑制喪失與基因損傷增加[7]。研究[8]表明去除腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化可影響腫瘤活性，DNA甲基化干預(yù)成為腫瘤新型治療策略的研究熱點(diǎn)。

CNRIP1是一個(gè)由164個(gè)氨基酸組成的蛋白，作為G蛋白偶聯(lián)受體與大麻素受體1的C末端相互作用，是CNRIP家族成員之一，在正常人的腦組織中有表達(dá)，在睪丸中也有較低水平的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)食欲、突觸可塑性及神經(jīng)保護(hù)作用等[2-3]。近來研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌細(xì)胞存在較高程度的CNRIP1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，但其作用尚不清楚。我們前期采用焦磷酸測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺癌患者CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)位點(diǎn)甲基化程度高，其甲基化程度分別與腫瘤直徑、原發(fā)灶浸潤深度、TNM分期正相關(guān)，CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度可反映結(jié)腸癌進(jìn)展程度[9]。本研究中，我們采用5-azaC干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)5個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平降低，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力均減弱，提示CNRIP1去甲基化可降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移活性。

DNA甲基化與腫瘤的能量代謝有著密切聯(lián)系[10]，而惡性腫瘤細(xì)胞即使在氧充足條件下仍以糖酵解為主要供能方式，這種有氧糖酵解代謝特性被稱為Warburg效應(yīng)[11]。因此，監(jiān)測糖酵解途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)及乳酸的生成對于評估腫瘤能量來源具有重要意義。HK是糖酵解途徑第一個(gè)限速酶，HK2在4種同工酶中與腫瘤相關(guān)性最大[12]。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP變?yōu)楸岷虯TP，是糖酵解過程主要限速酶之一；PKM2是腫瘤細(xì)胞中丙酮酸激酶的主要亞型[13]。LDH是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的限速酶，其中LDH-A(即LDH-5、M4 型)與腫瘤生長密切相關(guān)[14]。乳酸是細(xì)胞糖酵解的最終產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，與未干預(yù)組相比，5-azaC干預(yù)組結(jié)腸癌細(xì)胞中HK2、PKM2、LDH-A mRNA及蛋白表達(dá)水平及乳酸含量均降低，表明CNRIP1去甲基化可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解途徑、減少乳酸生成，可能通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)，減少其獲取能量，抑制其增殖及遷移能力。

綜上所述，CNRIP1可能是一種抑癌基因或修復(fù)基因；CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化可能通過抑制糖酵解途徑，進(jìn)而降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。CNRIP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化可作為結(jié)腸癌治療策略的一個(gè)新選擇。

[1] SMITH TH,BLUME LC,STRAIKER A,et al.Cannabinoid receptor-interacting protein 1a modulates CB1 receptor signaling and regulation[J].Mol Pharmacol,2015,87(4):747

[2] ZHENG X,SUZUKI T,TAKAHASHI C,et al.cnrip1 is a regulator of eye and neural development in Xenopus laevis[J].Genes Cells,2015,20(4):324

[3] SMITH TH,SIM-SELLEY LJ,SELLEY DE.Cannabinoid CB1 receptor-interacting proteins: novel targets for central nervous system drug discovery?[J].Br J Pharmacol,2010,160(3):454

[4] LIND GE,DANIELSEN SA,AHLQUIST T,et al.Identification of an epigenetic biomarker panel with high sensitivity and specificity for colorectal cancer and adenomas[J].Mol Cancer,2011,10:85

[5] OSTER B,THORSEN K,LAMY P,et al.Identification and validation of highly frequent CpG island hypermethylation in colorectal adenomas and carcinomas[J].Int J Cancer,2011,129(12):2855

[6] BETHGE N,LOTHE RA,HONNE H,et al.Colorectal cancer DNA methylation marker panel validated with high performance in Non-Hodgkin lymphoma[J].Epigenetics,2014,9(3):428

[7] KULIS M,ESTELLER M.DNA methylation and cancer[J].Adv Genet,2010,70:27

[8] CHEISHVILI D,BOUREAU L,SZYF M.DNA demethylation and invasive cancer: implications for therapeutics[J].Br J Pharmacol,2015,172(11):2705

[9] 張婷,崔戈,馮文明,等.結(jié)直腸腺癌患者外周血CNRIP1基因啟動(dòng)子甲基化的臨床病理學(xué)分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(10):1086

[10]BARRES R,ZIERATH JR.DNA methylation in metabolic disorders[J].Am J Clin Nutr,2011,93(4):897S

[11]WARBURG O.On the origin of cancer cells[J].Science,1956,123(3191):309

[12]PATRA KC,HAY N.Hexokinase 2 as oncotarget[J].Oncotarget,2013,4(11):1862

[13]LI C,ZHAO Z,ZHOU Z,et al.PKM2 promotes cell survival and invasion under metabolic stress by enhancing Warburg effect in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Dig Dis Sci,2016,61(3):767

[14]MIAO P,SHENG S,SUN X,et al.Lactate dehydrogenase A in cancer:a promising target for diagnosis and therapy[J].IUBMB Life,2013,65(11):904