呂曉東，周 玲，郭 珍，宋永平

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)中心實驗室 鄭州 450008

近年來，新藥的使用和支持治療的進步大大提高了惡性血液病的治療效果，但由于化療后伴隨長時間的中性粒細胞減少，以及免疫抑制劑和廣譜抗生素的使用等因素，侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的發(fā)病率逐年升高，病死率達到19%～49%[1-2]。IC診斷的金標準是血培養(yǎng)，但培養(yǎng)的敏感性低、時間長。1,3-β-D葡聚糖(1,3-β-D glucan, BG)檢測現(xiàn)作為常規(guī)的IC血清學(xué)檢測，但其干擾因素較多，特別是惡性血液病患者治療過程中的中性粒細胞減少以及抗真菌藥物的預(yù)防性使用等因素，很大程度上影響了G試驗的結(jié)果。本研究旨在通過G試驗聯(lián)合念珠菌抗原甘露聚糖(mannan, Mn)檢測，及其IgG抗體(Mn-IgG)和IgM抗體(Mn-IgM)的檢測，評價念珠菌抗原、抗體聯(lián)合檢測在惡性血液病患者IC診斷中的臨床價值及其影響因素。

1 對象與方法

1.1研究對象及標本采集2015年10月至2017年2月于河南省腫瘤醫(yī)院血液科住院的64例患者(男36例，女28例，年齡7～85歲)納入IC組，入組患者均符合文獻[3]診斷標準。根據(jù)患者中性粒細胞計數(shù)分為5組：中性粒細胞減少Ⅰ級組17例(1.5×109L-1≤中性粒細胞<2.0×109L-1)，中性粒細胞減少Ⅱ級組14例(1.0×109L-1≤中性粒細胞<1.5×109L-1)，中性粒細胞減少Ⅲ級組7例(0.5×109L-1≤中性粒細胞<1.0×109L-1)，中性粒細胞缺乏組7例(中性粒細胞<0.5×109L-1)，非中性粒細胞減少組19例(中性粒細胞≥2.0×109L-1)。根據(jù)檢測時是否使用抗念珠菌藥物分為2組：用藥組41例，未用藥組23例。取同期健康體檢人群作為對照組(共45例，男27例，女18例，年齡27～72歲)。所有入組患者均經(jīng)本人或委托家屬簽署知情同意書后晨起空腹采血3 mL，2 000 r/min離心10 min，分離血清，標本保存于-20 ℃，避免反復(fù)凍融。初次G試驗陽性者，48 h內(nèi)采血進行第2次G試驗復(fù)檢。

1.2檢測試劑和儀器采用天津丹娜生物科技有限公司的BG定量檢測試劑盒(動態(tài)顯色法)、Mn檢測試劑盒(ELISA法)、Mn-IgG和Mn-IgM抗體定量檢測試劑盒(ELISA法)進行測定。酶標儀型號為SUNRISE，由瑞士Tecan公司生產(chǎn)。操作過程嚴格按照說明書進行。

1.3檢測結(jié)果判定標準G試驗， >95 ng/L為陽性，<70 ng/L為陰性，70～95 ng/L為灰區(qū)；Mn檢測，>1.0 μg/L為陽性，<0.5 μg/L為陰性，0.5～1.0 μg/L為灰區(qū)；Mn-IgG和Mn-IgM檢測，>60 000 AU/L為陽性，<50 000 AU/L為陰性，50 000～60 000 AU/L為灰區(qū)。本研究將各項檢測灰區(qū)結(jié)果歸為陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。不同組間各指標檢測結(jié)果的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；應(yīng)用ROC曲線評價不同抗原、抗體及聯(lián)合檢測在惡性血液病患者IC中的臨床檢出效果，分別計算并比較其敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1念珠菌抗原、抗體單獨檢測和聯(lián)合檢測結(jié)果IC組和對照組念珠菌抗原、抗體檢測結(jié)果見表1，各項檢測指標及其聯(lián)合檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)見表2，ROC曲線見圖1。

表1 IC組和對照組的念珠菌抗原、抗體檢測結(jié)果 例(%)

*：Fisher確切概率法

表2 念珠菌抗原、抗體單獨和聯(lián)合檢測的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)

各檢測指標的AUC(95%CI)：G試驗，0.649(0.573～0.725)；Mn-IgG+Mn-IgM，0.709(0.637～0.781)；Mn，0.768(0.702～0.834)；G試驗+Mn+Mn-IgG+Mn-IgM，0.830(0.771～0.888)圖1 念珠菌抗原、抗體檢測的ROC曲線對比

2.2中性粒細胞減少對念珠菌抗原、抗體檢測的影響結(jié)果見表3。

表3 中性粒細胞減少和抗真菌藥物預(yù)防使用對念珠菌抗原及抗體檢測的影響 例(%)

*:Fisher確切概率法

2.3抗真菌藥物的使用對念珠菌抗原、抗體檢測的影響結(jié)果見表3?？芍?，未用藥組G試驗陽性率高于用藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

IC是惡性血液病患者接受化療或造血干細胞移植后常見的并發(fā)癥。而目前G試驗的干擾因素較多，因此需要更加快捷、敏感、特異的檢測指標。BG是大部分真菌細胞壁中的一種多糖成分，僅有少數(shù)的真菌不含有或表達水平很低[4]。該檢測的優(yōu)勢在于它所能檢測真菌的范圍較廣，相對于真菌培養(yǎng)(2 d以上)更能節(jié)約時間。它的缺點在于不能區(qū)分念珠菌和曲霉菌，且干擾因素較多，例如透析、血液及血制品的輸注、細菌感染、β-內(nèi)酰胺類抗生素和白蛋白的使用等[5]。本研究中，G試驗結(jié)果與以往文獻[6]報道的G試驗的敏感性和特異性相近。而對照組中出現(xiàn)的9例G試驗陽性，根據(jù)后期跟蹤隨訪，推測可能為同期服用β-內(nèi)酰胺類抗生素或試驗污染等因素造成。另外，結(jié)果提示48 h內(nèi)連續(xù)2次G試驗對于IC的診斷更為準確，但由于2次檢測間可能會有臨床因素的干擾，如中性粒細胞缺乏、抗真菌藥物的使用等，可造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

Mn是念珠菌細胞壁中另一種具有高度免疫原性的多糖，并且可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgG和IgM抗體。有研究[7]顯示，Mn抗原、抗體單獨的敏感性是64.3%和61.5%，特異性是95.7%和71.4%。本研究結(jié)果中，Mn抗原檢測與上述研究相似，但相關(guān)抗體檢測的敏感性較低，而二者聯(lián)合檢測，可以提高敏感性。作者推測，抗體檢測敏感性低，可能與惡性血液病患者自身免疫功能紊亂、免疫力低下有關(guān)。因此，對于惡性血液病患者，念珠菌抗體檢測不適合作為單獨檢測指標。

在回顧性分析162例Mn抗原、抗體聯(lián)合檢測的相關(guān)研究中，91例被證實為IC，敏感性77%，特異性51%[8]。作者發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的敏感性明顯高于各項指標單獨檢測的敏感性。念珠菌抗原、抗體聯(lián)合檢測的AUC高于其他指標單獨檢測時的AUC，提示念珠菌抗原、抗體多重指標聯(lián)合檢測優(yōu)于單獨檢測，可以更加敏感、準確地診斷IC。

惡性血液病患者由于自身疾病特點常伴隨化療后較長時間的中性粒細胞減少，這是真菌感染的高危因素。作者發(fā)現(xiàn)中性粒細胞缺乏組G試驗和Mn抗原檢測的陽性率均較低。以往研究[9]證實，念珠菌的細胞壁主要由兩層構(gòu)成，Mn主要富集于外層表面，而BG和甲殼素主要存在于內(nèi)層。念珠菌侵犯至體內(nèi)深部組織、器官時，被巨噬細胞吞噬或釋放細胞因子，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)而被清除[10]。檢測時的BG和Mn抗原均為真菌細胞壁的代謝產(chǎn)物，由此可用于區(qū)分念珠菌定植和IC[11]。因此作者推測，體內(nèi)中性粒細胞的缺乏也是真菌G試驗和Mn抗原檢測的假陰性因素之一。然而IgG、IgM抗體檢測的敏感性并沒有受到中性粒細胞缺乏的影響，據(jù)此念珠菌相關(guān)抗體檢測可以彌補中性粒細胞缺乏期抗原檢測敏感性不足的問題。

惡性血液病在治療過程中，由于存在真菌感染的高危因素，造成超過51%的患者存在經(jīng)驗性抗真菌治療，而其中75.6%的患者并沒有診斷為IC[12]。而抗真菌藥物的使用會抑制真菌的生長、阻滯真菌細胞壁的合成，造成檢測結(jié)果的假陰性。作者根據(jù)研究對象抗念珠菌藥物的使用情況，對比分析用藥對念珠菌檢測的影響，發(fā)現(xiàn)未用藥組G試驗檢測陽性率高于用藥組，與預(yù)期結(jié)果一致，提示抗真菌藥物的使用確實影響到抗原的檢測結(jié)果。而未用藥組中Mn抗原的檢測陽性率也高于用藥組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能為樣本數(shù)量的影響。真菌抗體的檢測并未受到抗真菌藥物的影響，但敏感性較低。真菌抗原、抗體聯(lián)合檢測時用藥組的檢出率為82.9%，雖然與未用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是可以很大程度上糾正預(yù)防性抗真菌藥物使用對檢測結(jié)果的影響。

惡性血液病患者是IC的高危人群，但由于念珠菌血清學(xué)檢測自身方法學(xué)的限制，受到多個假陽性和假陰性因素的干擾，其抗原、抗體聯(lián)合檢測可以提高IC檢測的敏感性和特異性，并克服臨床治療過程中常見的干擾因素，具有重要的臨床價值。

[1] DUCASSOU S,RIVAUD D,AUVRIGNON A,et al.Invasive fungal infections in pediatric acute myelogenous leukemia[J].Pediatr Infect Dis J,2015,34(11):1262

[2] 陳良安.侵襲性念珠菌病的診治進展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2010,35(7):759

[3] 中國侵襲性真菌感染工作組.血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則：第五次修訂版[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實踐,2017,52(20):201

[4] MCCARTHY MW,PETRAITIENE R,WALSH TJ.Translational development and application of (1→3)-β-d-glucan for diagnosis and therapeutic monitoring of invasive mycoses[J].Int J Mol Sci,2017,18(6):E1124

[5] MIKULSKA M,FURFARO E,VISCOLI C.Non-cultural methods for the diagnosis of invasive fungal disease[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2015,13(1):103

[6] LEHRNBECHER T,ROBINSON PD,FISHER BT,et al.Galactomannan, β-D-glucan, and polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of invasive fungal disease in pediatric cancer and hematopoietic stem cell transplantation: a systematic review and meta-analysis[J].Clin Infect Dis,2016,63(10):1340

[8] CHUMPITAZI BF,LEBEAU B,FAURE-COGNET O,et al.Characteristic and clinical relevance of candida mannan test in the diagnosis of probable invasive candidiasis[J].Med Mycol,2014,52(5):462

[9] GOW NA,VAN DE VEERDONK FL,BROWN AJ,et al.Candida albicans morphogenesis and host defence: discriminating invasion from colonization[J].Nat Rev Microbiol,2011,10(2):112

[10]KLIPPEL N,CUI S,GROEBE L,et al.Deletion of the candida albicans histidine kinase gene CHK1 improves recognition by phagocytes through an increased exposure of cell wall beta-1,3-glucans[J].Microbiology,2010,156(Pt 11):3432

[12]OKINAKA K.Candidemia in cancer patients: focus mainly on hematological malignancy and hematopoietic stem cell transplantation[J].Med Mycol J,2016,57(3):J117