劉 悅，馬沛沛，吳士文

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性的X連鎖隱性肌肉變性疾病，其發(fā)病是由抗肌萎縮蛋白基因移碼突變所致。如不接受治療，DMD患兒在10歲左右喪失行走能力，大多數(shù)患兒最終臥床不起，并發(fā)關(guān)節(jié)攣縮、褥瘡、肺炎，而在20歲前死亡。在過(guò)去幾十年中，憑借著糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）的應(yīng)用[1]，多學(xué)科綜合護(hù)理水平的提高，心臟和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的處理，DMD的病程發(fā)展發(fā)生了顯著改變，男性患病可生存至30～40歲。由于臨床對(duì)已出生DMD患者治療措施有限，因此，研究者們已將治療戰(zhàn)略從針對(duì)疾病修飾途徑的藥理學(xué)治療逐步擴(kuò)展到糾正潛在基因突變的生物治療，如依靠胚胎植入前遺傳學(xué)診斷、產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展預(yù)防患病胎兒出生。現(xiàn)將DMD生物學(xué)治療進(jìn)展作一綜述。

1 針對(duì)致病基因

1.1 靶向致病基因脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） （1）基因替代療法目前具有很大潛力，具體操作為通過(guò)將功能性DMD基因轉(zhuǎn)移到DMD患者的骨骼肌、心肌細(xì)胞，從而恢復(fù)其抗肌萎縮蛋白。然而，dystrophy全基因組長(zhǎng)度達(dá)2.3 Mb，難以被多數(shù)病毒基因載體包裝運(yùn)載。有研究發(fā)現(xiàn)在mdx小鼠模型局部注射的小型肌萎縮蛋白，盡管缺少約70%的編碼序列，但仍可保護(hù)mdx小鼠的四肢肌肉和心臟[2,3]。同樣，在貝克肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（Becker muscular dystrophy，BMD）患者中，研究發(fā)現(xiàn)注射小型或微型抗肌萎縮蛋白可使患者臨床癥狀減輕[4]?；谏鲜鲎C據(jù)，腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）介導(dǎo)的微型抗肌萎縮蛋白基因治療應(yīng)運(yùn)而生。研究表明微型抗肌萎縮蛋白基因治療可降低DMD動(dòng)物模型肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平并顯著改善其肌肉萎縮表現(xiàn)[3]。（2）基因定向編輯。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其上游還有一個(gè)多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域發(fā)生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)可識(shí)別外源DNA，并將它們切斷以沉默外源基因的表達(dá)，正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)成一種高效的基因編輯工具。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、應(yīng)用最成熟的一類。當(dāng)Cas9的內(nèi)切核酸酶與向?qū)Ш颂呛怂幔╣uide Ribonucleic acid，gRNA）鏈結(jié)合時(shí)，可精確切割基因組[5]。體外研究表明，CRISPR / Cas9技術(shù)可用于許多不同的突變，包括占DMD突變譜12%～15%的多外顯子重復(fù)[6]。根據(jù)大多數(shù)重復(fù)區(qū)域頭尾結(jié)構(gòu)，一個(gè)gRNA就可去除突變并恢復(fù)全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白，AAV載體的限制就不再是問(wèn)題。且Long等[7]已在mdx小鼠模型中證明了CRISPR / Cas9介導(dǎo)恢復(fù)體內(nèi)DMD開(kāi)放閱讀框的治療潛力。

1.2 靶向致病基因核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）DMD基因突變中外顯子缺失突變最常見(jiàn)，占55%～65%。缺失突變包括移碼編碼和整碼突變兩種類型，移碼突變破壞了開(kāi)放閱讀框，從而導(dǎo)致患者不能產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白。整碼突變雖然也破壞了開(kāi)放閱讀框，但可產(chǎn)生縮短的、有一定功能的抗肌萎縮蛋白，導(dǎo)致臨床癥狀較輕的BMD。外顯子跳躍技術(shù)是通過(guò)引入跳過(guò)一個(gè)或多個(gè)靶向外顯子的替代剪接位點(diǎn)，將DMD患兒的移碼突變類型修改為整碼突變類型，這樣就有可能使臨床癥狀較重的DMD轉(zhuǎn)換為癥狀較輕的BMD[8]。反義寡核苷酸是一種修飾合成的核酸鏈，其長(zhǎng)度通常為20～30個(gè)核苷酸，由抗肌萎縮蛋白前體信使RNA（messenger RNA，mRNA）的互補(bǔ)序列組成，通過(guò)與mRNA上要去除的外顯子剪切序列雜交，干擾剪切機(jī)制，從而導(dǎo)致該外顯子跳躍來(lái)恢復(fù)閱讀框。目前，已有多種反義寡核苷酸被開(kāi)發(fā)合成。

外顯子 45～50，47～50，48～50，49～50，50，52 或 52～63缺失所致的移碼突變均可通過(guò)跳躍51號(hào)外顯子轉(zhuǎn)變?yōu)檎a突變，這將治療大約13%的DMD患者[8]。2'O-甲基低聚核糖核苷硫代磷酸酯（2'O-methyl-ribo-oligonucleosidephosphorothioate，2'OMePS）和磷酸二酰胺嗎啉低聚物（phosphorodiami-date morpholinooligomers，PMOs）是兩種靶向外顯子51的寡聚體，但其生物化學(xué)結(jié)構(gòu)、對(duì)內(nèi)切核酸酶的穩(wěn)定性和毒性特征均不同。一系列臨床前研究成功驗(yàn)證了2'OMePS和PMOs在DMD治療中的潛力[9,10]。其中，Yokota等[10]發(fā)現(xiàn)對(duì)肌營(yíng)養(yǎng)不良犬模型進(jìn)行肌內(nèi)注射2'OMePS和PMOs可介導(dǎo)有效的外顯子跳躍，增加抗肌萎縮蛋白表達(dá)，改善其臨床表型。隨后，研究者們對(duì)2'OMePS寡聚物（drisapersen）和PMO（eteplirsen）進(jìn)行了一系列系統(tǒng)的臨床試驗(yàn)。在一個(gè)為期48周的研究中，18名患者以每周6 mg/kg的劑量皮下施用drisapersen（連續(xù)方案）；另一組17名患者則在6周內(nèi)接受了9次注射，然后中斷4周（間歇性方案）；第三組18名患者接受安慰劑治療。24周后，相比安慰劑組，連續(xù)方案組患者步行距離顯著增加（約35 m）。但由于研究結(jié)果顯示藥物的改善作用不夠突出，且出現(xiàn)了蛋白尿等不良反應(yīng)[11]，目前該試驗(yàn)已被取消。在一項(xiàng)納入12名DMD男孩的雙盲試驗(yàn)中，一組接受每周一次30 mg/kg eteplirsen靜脈給藥，另一組接受每周一次50 mg/kg eteplirsen靜脈給藥；第三組給予安慰劑。48周后，eteplirsen組與對(duì)照組相比，行走距離均延長(zhǎng)，活檢中抗肌萎縮蛋白增加了40%～50%，并且該藥耐受性良好[12]。2016年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局宣布如果該藥能成功完成，且完成藥物上市后公司承諾的其他額外試驗(yàn)[13]，將加速批準(zhǔn)eteplirsen的臨床應(yīng)用。

1.3 靶向致病基因編碼蛋白 約15%DMD具有提前終止密碼子，這導(dǎo)致了DMD的mRNA衰變和/或蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)早停止，最后產(chǎn)生截短的、無(wú)功能的蛋白質(zhì)。ataluren（PTC124，商品名Tranlsarna）能夠降低核糖體對(duì)過(guò)早終止密碼子的敏感性，造成所謂“終止密碼子通讀”[14]，使含有無(wú)義突變的基因產(chǎn)生功能性蛋白。但是，目前ataluren的作用機(jī)制尚存在爭(zhēng)議[15]。

2014年，歐洲藥品管理局和歐洲委員會(huì)批準(zhǔn)Translarna品牌藥物用于治療無(wú)義突變的DMD患者。Bushby等[16]在同年進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)雙盲多中心試驗(yàn)，納入173名年齡5～20歲的DMD患者。治療48周后，口服ataluren 40 mg/（kg·d）的研究對(duì)象（步行距離僅下降13 m）與安慰劑組相比（下降44 m）下降更為緩慢，且過(guò)程中未報(bào)告嚴(yán)重不良事件。2017年完成的第二個(gè)atalurenⅢ期臨床試驗(yàn)未能達(dá)到預(yù)期的穩(wěn)定6 min步行距離，且大部分DMD患者無(wú)顯著癥狀改善[17]。但對(duì)第一次和第二次試驗(yàn)結(jié)果的薈萃分析顯示，用藥后在臨床癥狀改善和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上均顯示患者受益，特別是對(duì)6 min步行距離測(cè)試成績(jī)300～400 m的患者，治療效果顯著[18]?；谝陨辖Y(jié)果，該類藥物的后續(xù)試驗(yàn)已在多個(gè)國(guó)家啟動(dòng)。

1.4 靶向相關(guān)信號(hào)通路/分子 抗肌萎縮蛋白缺失會(huì)導(dǎo)致肌細(xì)胞膜小的斷裂和撕裂，隨著時(shí)間推移導(dǎo)致膜不穩(wěn)定性增加，關(guān)鍵離子梯度改變和第二信使路徑破壞。許多治療方法試圖改善膜穩(wěn)定性或改變肌肉內(nèi)因抗肌萎縮蛋白缺失干擾的第二信使信號(hào)傳導(dǎo)途徑，另外，將失調(diào)的細(xì)胞內(nèi)途徑正常化也是目前的研究策略之一。例如，肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣三磷酸腺苷酶1的基因上調(diào)對(duì)mdx小鼠表型慢性鈣調(diào)節(jié)及改變興奮性收縮耦合和鈣穩(wěn)態(tài)的蘭尼堿受體（ryanodine receptor，RyR）中RyR1、RyR2的翻譯產(chǎn)生影響[19]，同樣，已有研究證明藥物Rycals有利于改善FK506結(jié)合蛋白與RyR的結(jié)合[20]。另一個(gè)重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)是肌肉生長(zhǎng)抑制素和骨橋蛋白參與的典型和非典型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)傳導(dǎo)，也已被證明在肌肉再生和組織纖維化形成中發(fā)揮作用[21]。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)的治療，如抑制肌生長(zhǎng)抑制素，同樣是目前是臨床試驗(yàn)的熱點(diǎn)。其他關(guān)鍵的下游途徑包括核因子κB和抗炎信號(hào)及靶向線粒體的化合物功能和組蛋白脫乙酰酶抑制劑也在進(jìn)行相應(yīng)的研究中[22,23]。

1.5 其他 抗肌萎縮蛋白曾被認(rèn)為只存在于肌纖維中。但近年Rudnicki及其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，其在肌肉干細(xì)胞中也可表達(dá)[24]。應(yīng)用CRISPR/Cas9對(duì)肌肉干細(xì)胞的基因進(jìn)行編輯也是目前的研究熱點(diǎn)。如何準(zhǔn)確靶標(biāo)肌肉干細(xì)胞，目前的方法仍需進(jìn)一步改進(jìn)。同時(shí)利用iPS細(xì)胞技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶或CRISPR糾正DMD基因突變的可能性盡管已在實(shí)驗(yàn)室得到驗(yàn)證[25]，但因可編程的核酸酶有致有害突變的可能，目前仍無(wú)法應(yīng)用于臨床。

2 針對(duì)臨床表型

2.1 上調(diào)抗肌萎縮蛋白替代蛋白 Utrophin蛋白是一種和抗肌萎縮蛋白具有相似組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)的同系物，分子量為395 kDa。Utrophin上調(diào)曾經(jīng)是DMD分子治療中首先被考慮的方法之一。Utrophin在子宮肌膜中無(wú)處不在，肌肉成熟時(shí)逐漸被抗肌萎縮蛋白取代。在成人肌肉中，Urophin在神經(jīng)肌肉和肌腱結(jié)中可見(jiàn)。在DMD患者和mdx小鼠模型的肌肉修復(fù)中觀察到，由于抗肌萎縮蛋白的缺失，Utrophin表達(dá)自然增加，以重建肌肉纖維的連續(xù)性[23]。盡管兩種蛋白質(zhì)之間存在一些不同的功能特征，但已有研究表明，Utrophin可在mdx小鼠肌肉中起到有效的替代作用。而ezutromid被發(fā)現(xiàn)具有上調(diào)Utrophin蛋白表達(dá)的作用，且已在健康志愿者身上證明其安全性[26]。ezutromid應(yīng)用于DMD患者的有效性和安全性研究目前正在進(jìn)行中，這項(xiàng)歷時(shí)48周的試驗(yàn)招募了40名來(lái)自美國(guó)和英國(guó)的5～10歲男患兒，并將其分成兩組，各2次/d接受兩種ezutromid制劑中的一種，以確定哪種制劑將在未來(lái)的臨床試驗(yàn)中使用。試驗(yàn)?zāi)壳耙堰M(jìn)行至24周，通過(guò)肌肉活組織檢查發(fā)現(xiàn)，與基線相比，兩組肌肉損傷明顯減少，并伴有Utrophin蛋白的增加。

2.2 修復(fù)/重新密封受損細(xì)胞膜 Houang等[27]一直致力于開(kāi)發(fā)一種修復(fù)/重新密封DMD中損傷肌細(xì)胞膜的膜聚合物。在mdx小鼠和DMD狗模型中，候選藥物之一的泊洛沙姆P188已顯示出在修復(fù)/改善心肌病方面的潛力。另一種基于上述治療策略的分子是層粘連蛋白-111，它是一種天然存在的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白，功能是促進(jìn)ECM和肌膜之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)注射或全身注射層粘連蛋白-111可改善mdx小鼠的肌營(yíng)養(yǎng)不良表型[25]。但與P188一樣，層粘連蛋白-111也面臨著與藥物傳遞和分布相關(guān)的挑戰(zhàn)，這兩種藥物都尚未進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

總之，DMD的治療在過(guò)去十年中發(fā)生了巨大的變化，整體前景令人期待，但由于DMD病因復(fù)雜，將這些從各角度發(fā)現(xiàn)的治療方法轉(zhuǎn)化并運(yùn)用于臨床仍需克服許多障礙。未來(lái)仍需多學(xué)科協(xié)同、組合治療共同改善DMD的臨床癥狀和整體生活質(zhì)量。

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