楊菲，張愛紅，孟凡思，霍良占，李希望，邸墊平，苗洪芹

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大麥黃條點(diǎn)花葉病毒的分布及其分離物的遺傳多樣性

楊菲，張愛紅，孟凡思，霍良占，李希望，邸墊平，苗洪芹

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北保定 071000）

【目的】明確大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（，BYSMV）在中國(guó)北方小麥主產(chǎn)區(qū)的分布及其種群遺傳多樣性，為病害流行預(yù)警和防控提供理論依據(jù)。【方法】2008—2016年，在河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西等7個(gè)省66個(gè)縣/市/區(qū)田間，采集了864份疑似病毒病癥狀的植物樣品。提取樣品總RNA，利用一步法三重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)樣品中的BYSMV、水稻黑條矮縮病毒（，RBSDV）和北方禾谷花葉病毒（，NCMV）。利用RT-PCR擴(kuò)增獲得BYSMV的L和N基因片段，克隆并測(cè)定核苷酸序列，應(yīng)用MEGA、DnaSP和PAML等軟件分析BYSMV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性特征?！窘Y(jié)果】從48個(gè)縣/市/區(qū)采集的336份樣品中檢測(cè)到BYSMV，檢出率為38.89%，該病毒主要分布于陜西、河北、山西和山東，另外，河南及安徽北部亦有分布，江蘇徐州和邳州僅局部發(fā)生?；贐YSMV的L、N基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均可將分離物劃分為2個(gè)亞組，亞組I中的分離物其來(lái)源涉及全部7個(gè)省份，而亞組II中的分離物僅來(lái)自陜西和山西2個(gè)省，基于L基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明亞組II分離物與伊朗的分離物親緣關(guān)系較近，BYSMV的遺傳分化與分離物的地理來(lái)源相關(guān)，而與寄主植物、發(fā)生時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性。運(yùn)用RDP程序包的7個(gè)軟件進(jìn)行基因重組分析顯示沒有支持重組的證據(jù)。選擇壓力分析顯示，亞組內(nèi)和亞組間的ω（dN/dS）值（0.02—0.19）遠(yuǎn)小于1，表明群體正承受凈化選擇。L和N基因的單倍型多樣性（Hd）值（0.90909和0.99524）均大于0.5、核苷酸多樣性（π）值（0.01324和0.01224）均高于0.005，表明中國(guó)BYSMV群體遺傳多樣性豐富?；贚和N基因片段的遺傳分化研究顯示，東部和西部群體的遺傳分化系數(shù)（F）值（0.32201和0.37326）均大于0.25，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異顯著，表明東部和西部的BYSMV群體嚴(yán)重分化；基因流（Nm）值（0.53和0.42）均小于1，說(shuō)明有限的基因流是促使群體發(fā)生遺傳分化的主要原因。【結(jié)論】BYSMV在中國(guó)北方小麥主產(chǎn)區(qū)分布廣泛，河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西等地均有不同程度的發(fā)生。BYSMV群體具有豐富的遺傳多樣性，且東部和西部群體之間存在嚴(yán)重的遺傳分化。

大麥黃條點(diǎn)花葉病毒; 系統(tǒng)發(fā)生; 遺傳多樣性; 選擇壓力; 遺傳分化

0 引言

【研究意義】大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（，BYSMV）是灰飛虱（）傳播的一種彈狀病毒，侵染小麥、大麥、玉米、高粱等近30種禾本科植物[1]，在小麥上引起的病害十分嚴(yán)重，可造成植株嚴(yán)重矮化，葉片對(duì)生、細(xì)窄、扭曲和黃化等癥狀[2]。小麥?zhǔn)侵袊?guó)重要糧食作物，2014年筆者實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了在河北保定、石家莊麥田發(fā)現(xiàn)大麥黃條點(diǎn)花葉病毒[3]，該病毒的傳毒介體灰飛虱在小麥種植區(qū)廣泛分布，因此，調(diào)查明確大麥黃條點(diǎn)花葉病毒在北方小麥主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況，為病害防控預(yù)警提供理論依據(jù)，對(duì)于保障糧食安全生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大麥黃條點(diǎn)花葉病毒最初在灰飛虱體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)[4]，而后澳大利亞[5]、摩洛哥[6]、伊朗[7]、土耳其[8]、敘利亞[9]及阿根廷[10]等地相繼報(bào)道該病毒，其在伊朗引起嚴(yán)重的小麥和谷子病害[7]。大麥黃條點(diǎn)花葉病毒是細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬成員，其基因組為負(fù)單鏈RNA，Yan等[11]利用小RNA深度測(cè)序和組裝技術(shù)獲得了全長(zhǎng)約12.7 kb的基因組序列，基因結(jié)構(gòu)為3′ leader-N-P-3-4/5-6-M-G-9-L-5′ trailer，與其他彈狀病毒類似，分別編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、磷蛋白（phosphoprotein protein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、糖蛋白（glycoprotein protein，G）和聚合酶蛋白（polymerase protein，L），與北方禾谷花葉病毒（，NCMV）相應(yīng)氨基酸序列一致性為35%—62%。除5個(gè)基本的結(jié)構(gòu)蛋白以外，還編碼5個(gè)功能各異或功能未知的輔助蛋白（accessory protein），在基因P和Ｍ之間有3個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其中g(shù)ene 5是一個(gè)嵌套基因，編碼疏水蛋白，通過核糖體漏掃機(jī)制進(jìn)行蛋白翻譯，這種非常規(guī)的基因表達(dá)策略在其他植物彈狀病毒中未見報(bào)道，而在動(dòng)物彈狀病毒中較為常見。Almasi等[12]還報(bào)道了大麥黃條點(diǎn)花葉病毒伊朗分離物的L、P和G基因全長(zhǎng)序列（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）。植物病毒，特別是RNA病毒具有快速變異的能力。由于RNA聚合酶缺乏校對(duì)機(jī)制，RNA病毒具有很高的突變率，據(jù)估計(jì)堿基替換率為10-4[13-14]?；蜃儺悓?dǎo)致病毒宿主范圍和病害癥狀發(fā)生變化，甚至進(jìn)化為“新病毒”引起更嚴(yán)重的病害。研究表明，水稻條紋病毒（，RSV）[15]、大麥黃矮病毒（，BYDV）[16]和水稻黑條矮縮病毒（，RBSDV）[17]種群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)遺傳多樣性，重組是基因變異的主要方式。萵苣壞死黃化病毒（Lettuce necrotic yellows virus，LNYV）、草莓皺縮病毒（Strawberry crinkle virus，SCV）和茄子斑駁矮縮病毒（Eggplant mottled dwarf virus，EMDV）3種植物彈狀病毒田間分離物的L及N基因核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列存在相當(dāng)多的遺傳變異性，通過對(duì)萵苣壞死黃化病毒N基因的分析，澳大利亞和新西蘭的分離物被劃分為2個(gè)亞組[18]；根據(jù)對(duì)L基因片段的變異分析草莓皺縮病毒被分為2個(gè)亞組[19]；Pappi等[20]研究了不同地理起源的茄子斑駁矮縮病毒草本和木本植物分離物的N、X、P、Y、M、G基因編碼序列，不同分離物基于其地理來(lái)源可分成3個(gè)亞組?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】中國(guó)小麥種植區(qū)域極為廣泛，生態(tài)環(huán)境多樣，目前大麥黃條點(diǎn)花葉病毒在不同地區(qū)的發(fā)生動(dòng)態(tài)尚不明確，小麥病害流行預(yù)警和防控策略缺乏理論依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用分子生物學(xué)方法鑒定麥田灰飛虱傳播的病毒種類，并對(duì)大麥黃條點(diǎn)花葉病毒的基因序列進(jìn)行分析，明確大麥黃條點(diǎn)花葉病毒在小麥種植區(qū)的分布及遺傳多樣性特征，為有效防控該病毒引起的病害打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2008—2016年分別于河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西7省田間調(diào)查，采集植株矮化、旗葉發(fā)黃等疑似感染病毒的小麥、玉米、雜草葉片，保存于-70℃冰箱。部分病株樣品采集時(shí)間、采樣地點(diǎn)、寄主植物等信息列于表1。病毒檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照是通過室內(nèi)人工接種大麥黃條點(diǎn)花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒和北方禾谷花葉病毒而獲得表現(xiàn)癥狀的小麥病株，陰性對(duì)照為未接種病毒的健康小麥。

試劑及儀器：RNA提取試劑、一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、Dream Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR試劑均購(gòu)自Thermo Scientific公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。Veriti PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DYY-12型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GBOXF3凝膠成像分析系統(tǒng)，英國(guó)Syngene公司。

1.2 總RNA提取方法

參照康為世紀(jì)TRIzon試劑盒說(shuō)明書提取樣品總RNA，經(jīng)NanoDrop ND2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒檢測(cè)

采用大麥黃條點(diǎn)花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒和北方禾谷花葉病毒特異性引物BYSMVF：5′-TCCGCA GGTAGACGCCAAGAAG-3′和BYSMVR：5′-CGCAG TCCCAGTCAGAAAGGTG-3′、RBSDVF：5′-TTGGGA TTTGGTCGTCGTAGAGCC-3′和RBSDVR：5′-AACT TCGCATGAACTGGGGTTGTC-3′、NCMVF：5′-AAA CAGAGCTTCACGGAGACTTGG-3′和NCMVR：5′-A ACACTAACCCTCCCACGTCTGTA-3′進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)樣品中的3種病毒?？傮w積12.5 μl的反應(yīng)體系中包括2×OneStep RT-PCR Buffer 6.25 μl，終濃度為0.1 μmol·L-1的引物各0.125 μl，HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.25 μl，模板樣品總RNA 1 μl，無(wú)核酸酶ddH2O 4.25 μl。反應(yīng)程序：45℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，65℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，65℃終延伸10 min。陽(yáng)性對(duì)照為混合的3個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的總RNA，陰性對(duì)照為未接種的健康小麥總RNA。

1.4 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒L、N基因引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已報(bào)道的大麥黃條點(diǎn)花葉病毒河北分離物（GenBank登錄號(hào)：KM213865）的L、N基因序列分別設(shè)計(jì)了1對(duì)引物。擴(kuò)增L基因片段的上下游引物序列分別位于L基因的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域上，產(chǎn)物全長(zhǎng)637 bp，中間387 bp的序列為非保守區(qū)；擴(kuò)增N基因片段的上下游引物分別位于N基因的兩端，可擴(kuò)增獲得N基因的全長(zhǎng)序列。引物由上海生工生物科技有限公司合成，序列信息見表2。

1.5 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒L、N基因RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序

第一鏈cDNA合成參照Thermo Scientific合成試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，上下游特異性引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL，10×Dream Taq Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol·L-1）0.2 μL，Dream Taq DNA聚合酶0.2 μL及ddH2O 15.6 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸110 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用TIANGEN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行切膠純化。參照TaKaRa公司pMD18-T Vector說(shuō)明書，將純化產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定，每個(gè)樣品挑選不少于3個(gè)陽(yáng)性克隆交由上海生工生物科技有限公司測(cè)序，挑選3個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果保持一致的序列用于遺傳多樣性分析。

表1 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒分離物信息

表2 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒L、N基因引物

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析與遺傳距離

選取大麥黃條點(diǎn)花葉病毒20個(gè)具有代表性的分離物（表1）及GenBank中河北分離物相應(yīng)序列（GenBank登錄號(hào)：KM213865），以GenBank中與大麥黃條點(diǎn)花葉病毒同屬的、親緣關(guān)系相近的北方禾谷花葉病毒相應(yīng)序列（GenBank登錄號(hào)：NC002251日本、GU985153河北）作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外族群，利用MEGA v6.0[21]軟件ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，刪除引物及gap；采用最大似然法作圖，自展1 000次，基于Tamura 3-parameter模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，不顯示小于50%的自展值。使用泊松校正方法計(jì)算各分離物間及系統(tǒng)發(fā)育樹各分組間的平均遺傳距離。以L基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，加入了GenBank中伊朗分離物的相應(yīng)序列（GenBank登錄號(hào)：FJ665628）。

1.7 遺傳重組和選擇壓力分析

由MEGA軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)，而后利用RDP v4.80程序包[22]進(jìn)行重組分析。該程序包RDP[23]、GENECONV[24]、MaxChi[25]、Bootscan[26]、Chimaera[27]、SiScan[28]和3Seq[29]有4種以上軟件分析結(jié)果支持重組，且p＜1.0×10-6時(shí)，該分離物被認(rèn)為存在“明確”重組，否則認(rèn)為不存在重組或存在“潛在”重組。

利用PAML v4.9c軟件包[30]中的codeml程序，使用位點(diǎn)模型對(duì)L和N基因進(jìn)行選擇壓力分析。根據(jù)ω（dN/dS）值衡量選擇壓力，ω＞1為正選擇，ω＜1為負(fù)選擇，ω=1為中性選擇[31-32]。設(shè)置參數(shù)Model=0，NSsites=0、1、2、3、7、8，對(duì)模型M0/M3、M1a/M2a和M7/M8進(jìn)行似然比檢驗(yàn)（LRT），評(píng)估合適的模型，通過PAML中的Bayesian方法計(jì)算發(fā)生正選擇的氨基酸位點(diǎn)[33-34]。

1.8 遺傳多樣性和遺傳分化分析

利用DnaSP v5[35]計(jì)算單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）等遺傳變異統(tǒng)計(jì)量，并計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)（FST）和基因流（Nm）。根據(jù)FST值判斷群體的分化程度，F(xiàn)ST值在0—0.05表示群體間不存在分化，在0.05—0.15為中度分化，在0.15—0.25為高度分化，＞0.25表明分化度極大。分別采用KS*、Z和Snn檢驗(yàn)群體間的遺傳分化顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒的分布

大麥黃條點(diǎn)花葉病毒與北方禾谷花葉病毒同為細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬成員，二者親緣關(guān)系相近，可在田間小麥上形成相似癥狀，而水稻黑條矮縮病毒也侵染小麥造成危害。應(yīng)用一步法三重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)田間疑似病毒侵染的小麥病株，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，BYSMV、RBSDV、NCMV基因擴(kuò)增片段大小分別為254、354和509 bp，陰性對(duì)照未擴(kuò)出任何條帶，田間病株樣品檢測(cè)出3種病毒，且有混合侵染發(fā)生（圖1）。

M：DL2000；1：陽(yáng)性對(duì)照Positive control；2：陰性對(duì)照Negative control；3—24：田間樣品Some of field samples

為探明BYSMV在中國(guó)北方小麥主產(chǎn)區(qū)的分布，共檢測(cè)了北方小麥主產(chǎn)區(qū)7個(gè)省66個(gè)縣/市/區(qū)的864份顯典型病毒病癥狀的小麥、玉米和雀麥病株樣品。檢測(cè)結(jié)果表明，其中48個(gè)縣/市/區(qū)采集的336份樣品檢測(cè)到BYSMV，平均檢出率為38.89%。陜西的樣品檢出率最高，為85.71%，其次為河北的檢出率63.05%，而江蘇的檢出率最低為13.18%。因此，BYSMV在調(diào)查的7個(gè)省份均有分布，且主要分布于陜西、河北、山西、山東，在河南及安徽北部亦有分布，在江蘇徐州和邳州僅局部發(fā)生（表3）。

表3 不同地區(qū)標(biāo)樣中大麥黃條點(diǎn)花葉病毒、水稻黑條矮縮病毒和北方禾谷花葉病毒的檢測(cè)結(jié)果

此外，36份樣品中檢測(cè)到RBSDV，157份樣品檢測(cè)到NCMV。河南樣品中NCMV的檢出率最高，為50.34%；其次為安徽，NCMV檢出率為35.71%；山東、河北、陜西和山西的樣品中NCMV檢出率為7.28%—15.09%。因此，NCMV在除江蘇以外的6省均有分布，且主要分布于河南及安徽北部；在采樣最密集的河北，僅在北部唐山和南部邯鄲兩地發(fā)現(xiàn)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于L基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可將22個(gè)BYSMV分離物劃分為2個(gè)亞組（亞組I和II）。山西2個(gè)分離物SXQW39和SXYC34以及陜西分離物SAXWN30與伊朗分離物歸為亞組II，其余17個(gè)分離物與河北分離物歸為亞組I，2個(gè)亞組均與NCMV外族群明顯劃分開來(lái)（圖2-a）。亞組I、亞組II分離物間平均遺傳距離分別為0.0039、0.0062，2個(gè)亞組間遺傳距離為0.0345（表4）。山西和陜西的分離物在2個(gè)亞組中均有分布，而其余5省的分離物則均劃分在同一亞組中，說(shuō)明山西、陜西地區(qū)BYSMV的遺傳多樣性水平較高。亞組I的基因型的分布范圍較廣，為優(yōu)勢(shì)基因型。系統(tǒng)發(fā)育樹分組與寄主植物和采樣時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性。

基于N基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可將21個(gè)BYSMV分離物可以劃分為2個(gè)亞組（亞組I和II）。其中山西3個(gè)分離物SXQW39、SXYC36、SXYC34和陜西分離物SAXWN30劃為亞組II，其余16個(gè)分離物與河北分離物歸為亞組I，2個(gè)亞組均與NCMV外族群明顯劃分開來(lái)（圖2-b）。亞組I分離物間平均遺傳距離為0.0053，亞組II為0.0049，2個(gè)亞組間遺傳距離為0.0273（表4）。

圖2 基于大麥黃條點(diǎn)花葉病毒L（a）、N（b）基因片段的系統(tǒng)發(fā)生樹（以北方禾谷花葉病毒為外群）

對(duì)比L和N基因的建樹結(jié)果，發(fā)現(xiàn)N基因片段構(gòu)建的樹同樣顯示山西、陜西地區(qū)BYSMV群體的具有較高的遺傳多樣性水平，且亞組I的基因型為優(yōu)勢(shì)基因型；此外，編號(hào)為SXYC36的山西分離物在以L基因片段和N基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中分別屬于亞組I和亞組II，推測(cè)該分離物的基因組可能發(fā)生了重組。

表4 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒亞組內(nèi)和亞組間的平均遺傳距離

2.3 遺傳重組及選擇壓力

RDP、GENECONV、MaxChi、Bootscan、Chimaera、SiScan和3Seq對(duì)L和N基因片段進(jìn)行遺傳重組分析，均未發(fā)現(xiàn)基因重組證據(jù)。

對(duì)L和N基因片段的選擇壓力分析表明，在M0（one ratio）模式下，亞組內(nèi)和亞組間的ω（dN/dS）值的變異范圍是0.02—0.19，遠(yuǎn)小于1，沒有直接證據(jù)表明存在正選擇（表5）。不同模型似然值lnL卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明M0與M3差異不顯著，表明不同位點(diǎn)受到的選擇壓力沒有差異；M1a（neutral）和M2a（selection）差異不顯著，M2a未能檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)；M7（beta）和M8（beta & ω）差異不顯著，M8未能檢測(cè)到正選擇位點(diǎn)。因此，L和N基因片段均受到較強(qiáng)的凈化選擇的約束。

2.4 遺傳多樣性及遺傳分化

遺傳多樣性分析表明，L基因和N基因變異均為堿基置換，其中L基因共有42個(gè)（7.07%）多態(tài)性位點(diǎn)（polymorphic sites），有34個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)是密碼子的第3堿基置換，此外有5個(gè)和3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)堿基置換分別是密碼子的第2堿基和第1堿基。N基因共有76個(gè)（6.13%）多態(tài)性位點(diǎn)（表5），密碼子第3堿基置換的有63個(gè)，密碼子的第1堿基和第2堿基置換的分別有9個(gè)和4個(gè)。L基因和N基因均無(wú)插入/缺失突變。

22個(gè)分離物的L基因中共檢測(cè)到16種單倍型，其中15種見于單個(gè)分離物，1種為7個(gè)分離物共有。21個(gè)分離物的N基因中共檢測(cè)到20種單倍型，其中19種見于單個(gè)分離物，1種為2個(gè)分離物共有。L和N基因的Hd值均大于0.5、π值均高于0.005，表明中國(guó)BYSMV群體遺傳多樣性高（表5）。

根據(jù)地理來(lái)源，將河北、山東、河南、安徽、江蘇的分離物劃分為東部群體，山西、陜西和伊朗的分離物劃分為西部群體，以L和N基因?yàn)榉肿訕?biāo)記分析BYSMV的分化程度，結(jié)果表明東部、西部群體的F值為0.32201和0.37326，均大于0.25（wright，1978），且、、3種統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著（＜0.05），表明東部和西部的BYSMV群體嚴(yán)重分化，而且差異顯著（表6）?；蛄鳎∟m）值分別為0.53和0.42，均小于1，說(shuō)明有限的基因流是促使群體發(fā)生遺傳分化的主要原因。

表5 基于L和N基因片段的遺傳多樣性分析

表6 大麥黃條點(diǎn)花葉病毒遺傳分化分析

*表示排列檢驗(yàn)重復(fù)1 000次得到的值在0.01—0.05，**表示0.001＜＜0.01，***表示＜0.001

* means significant difference at 0.01＜＜0.05 level by permutation test with 1 000 replicates; ** means 0.001＜＜0.01; *** means＜0.001

3 討論

本研究通過對(duì)中國(guó)北方小麥主產(chǎn)區(qū)田間調(diào)查和病株樣品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（BYSMV）在河北、山東、山西、陜西、河南北部等地已有廣泛分布。分析不同時(shí)期樣品檢測(cè)結(jié)果表明，2010年BYSMV的檢出率為38.89%，而2016年的檢出率上升至48.89%，因此大麥黃條點(diǎn)花葉病毒田間危害有蔓延趨勢(shì)。北方禾谷花葉病毒（NCMV）曾在河北等地造成嚴(yán)重危害[36]，但近年來(lái)其流行危害減輕，田間調(diào)查和室內(nèi)病毒檢測(cè)也進(jìn)一步證實(shí)NCMV的檢出率降低，2010年在河北、河南、山東和山西4省疑似感染病毒的小麥中NCMV的檢出率達(dá)91.3%[37]，但到2016年降至18.08%，而且2015—2016年河北廊坊、保定、石家莊、衡水、邢臺(tái)、滄州及山西運(yùn)城等地樣品中均未再檢測(cè)到NCMV。BYSMV與NCMV的氨基酸相似性為35%—62%[11]，且二者均由介體灰飛虱傳播，但BYSMV與 NCMV的流行趨勢(shì)則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果，2種病毒的發(fā)生動(dòng)態(tài)變化與環(huán)境、介體和寄主的相互關(guān)系值得深入研究。

基于BYSMV分離物L(fēng)和N基因片段的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BYSMV分離物均可被分為2個(gè)亞組，分組與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性；亞組I的基因型在中國(guó)北方分布范圍廣，在群體中所占比例高，為優(yōu)勢(shì)基因型；亞組II的基因型僅在山西、陜西分布，在基于L基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中該基因型伊朗分離物親緣關(guān)系較近[12]。此外，研究顯示有限的基因交流頻率促使BYSMV種群有較高的遺傳分化，因此，推測(cè)地理隔離是BYSMV種群分化的主要原因。目前關(guān)于BYSMV分離物基因序列的報(bào)道較少，BYSMV傳入中國(guó)的來(lái)源和途徑尚不清楚。

BYSMV是負(fù)單鏈RNA病毒，由于RNA病毒具有群體數(shù)量大、極高的復(fù)制速率、復(fù)合酶缺乏校對(duì)活性和基因組小等特點(diǎn)，基因組容易發(fā)生突變，從而增強(qiáng)病毒群體的適應(yīng)能力[38]。中國(guó)小麥種植區(qū)域廣泛，生態(tài)條件復(fù)雜，因此，BYSMV在局部地區(qū)極有可能暴發(fā)危害，及時(shí)監(jiān)控BYSMV的流行及基因變異動(dòng)態(tài)對(duì)于病害防控具有重要意義。

4 結(jié)論

大麥黃條點(diǎn)花葉病毒（BYSMV）在中國(guó)北方小麥主產(chǎn)區(qū)分布廣泛，河北、山東、江蘇、安徽、河南、陜西和山西等地均有不同程度的發(fā)生。系統(tǒng)發(fā)育分析可將BYSMV分離物分為2個(gè)亞組，分組與分離物的地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。BYSMV群體具有豐富的遺傳多樣性，且東部、西部群體之間存在嚴(yán)重的遺傳分化，有限的基因流是促使群體發(fā)生遺傳分化的主要原因。

致謝：

在樣品采集過程中得到江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所程兆榜研究員，西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉同先教授，河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所孔令曉研究員、紀(jì)莉景副研究員、閆沖，河北省第六人民醫(yī)院崔利軍主任，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院李洪連教授、孫炳劍副教授，山東省臨沂市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心李寶慶等的大力支持。在此一并表示感謝！

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Distribution and genetic diversity ofin northern China

YANG Fei, ZHANG AiHong, MENG FanSi, HUO LiangZhan, LI XiWang, DI DianPing,MIAO HongQin

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Center of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to clarify the distributionand genetic diversity of(BYSMV) in major wheat production areas in northern China, andto provide a theoretical basis for the early warning, prevention and control of epidemic diseases.【Method】During 2008-2016, about 864 suspected virus-infected samples were collected from 66 districts in Hebei, Shandong, Jiangsu, Anhui, Henan, Shaanxi and Shanxi provinces, all the three viruses including BYSMV,(RBSDV) and(NCMV) were identified using one-step multiplex RT-PCR. L and N gene fragments of BYSMV were obtained by RT-PCR amplification and cloned, and then determined by nucleotide sequence analysis. The sequences were analyzed by softwares of MEGA, DnaSP, and PAML to elucidate the phylogenesis and genetic diversity of BYSMV isolates. 【Result】A total of 336 samples collected from 48 districts in 7 provinces were detected with BYSMV and the detection rate was 38.89%. The virus was mainly distributed in Shaanxi, Hebei, Shanxi and Shandong. In addition, it was also distributed in Henan and northern Anhui. Xuzhou and Pizhou in Jiangsu Province were only localized. Phylogenetic analysis showed that the population could be divided into two subgroups (I and II) based on fragments of L and N genes. The isolates in subgroup I were derived from all 7 provinces, but isolates in subgroup II were only from Shaanxi and Shanxi provinces. It was indicated that Iran isolate was related to the subgroup II isolates based on the phylogenesis of L gene sequence. The clustering of the isolates was related to their geographical origins, andnot to the host plants or sampling dates.Genetic analysis by using 7 softwares of the RDP package showed that there was no evidence supported for therecombination. Selection stress analyses showed that the ω (dN/dS) values varied from 0.02 to 0.19 which were far less than 1 within or between subgroups. It was indicated that the population was undergoing purifying selection. Haplotype diversity (Hd) values (0.90909 and 0.99524) of L and N gene fragments were greater than 0.5 and nucleotide diversity (π) values (0.01324 and 0.01224) were higher than 0.005, indicating that there was a high level of genetic diversity in the population of BYSMV in China. genetic differentiation based on L and N gene fragments showed thatthe fixation indicesF(0.32201 and 0.37326) of eastern and western subpopulations were greater than 0.25. The difference of statistical test was significant, which indicated that the BYSMV population in eastern and western regions was seriously differentiated.The Nm values (0.53 and 0.42) were less than 1, which indicated that the limited gene flow was the main reason of genetic differentiation.【Conclusion】BYSMV is widely distributed in wheat producing areas of northern China, and occurred in Hebei, Shandong, Jiangsu, Anhui, Henan, Shaanxi and Shanxi provinces on different levels. The population of BYSMV had a high level of genetic diversity in China, and there is a severe genetic differentiation between the eastern and western subpopulations.

(BYSMV); phylogenesis; genetic diversity; selection pressure; genetic differentiation

2017-07-20；

2017-09-06

國(guó)家“973”計(jì)劃（2014CB138400）、植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（SKLOF201614）

楊菲，E-mail：feiyang_987@163.com。

邸墊平，E-mail：chmrdv@163.com。通信作者苗洪芹，E-mail：miao5058345@163.com