歐春青，姜淑苓，王斐，趙亞楠

?

梨全基因組生長(zhǎng)素反應(yīng)因子（ARF）基因家族鑒定及表達(dá)分析

歐春青，姜淑苓，王斐，趙亞楠

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧興城 125199）

【目的】明確梨轉(zhuǎn)錄因子在梨基因組中的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)差異，為揭示轉(zhuǎn)錄因子在梨樹生長(zhǎng)素信號(hào)途徑及在矮生梨生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定理論基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道的蘋果、擬南芥等植物中的轉(zhuǎn)錄因子基因，利用BLAST軟件鑒定梨基因組中的。采用SMART、PROSITE、WebLogo 3、DNAMAN 5.0、MEME、GSDS 2.0和MEGA 5.1等軟件對(duì)其蛋白和基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用qPCR方法檢測(cè)梨在矮生梨‘中矮1號(hào)’不同組織器官及3個(gè)不同生長(zhǎng)勢(shì)梨品種木質(zhì)部和韌皮部中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】鑒定得到31個(gè)梨，所有PbARF蛋白均含有1個(gè)Auxin_resp結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，除PbARF11、12、24、25和26外，其他序列的C末端還存在一個(gè)PB1（AUX_IAA）結(jié)構(gòu)域。保守元件分析表明，PbARF基因家族包含15個(gè)保守元件，并非每個(gè)蛋白均含有所有保守元件。分組鑒定和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，PbARF蛋白可以被分為4組。基因結(jié)構(gòu)分析表明，基因家族成員由2—15個(gè)外顯子組成，基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守。qPCR結(jié)果顯示，所有在‘中矮1號(hào)’根、韌皮部、木質(zhì)部、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，表達(dá)模式各有不同，在3個(gè)梨品種韌皮部中的表達(dá)表現(xiàn)出植株越矮表達(dá)量越高的趨勢(shì)，等4個(gè)基因在3個(gè)梨品種木質(zhì)部中的表達(dá)表現(xiàn)為植株越矮表達(dá)量越低的趨勢(shì)?！窘Y(jié)論】梨基因組中含有31個(gè)基因家族成員；所有PbARF蛋白均含有Auxin_resp和B3兩個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守；所有在‘中矮1號(hào)’不同組織器官、基砧杜梨根系及3個(gè)梨品種的木質(zhì)部和韌皮部中均有表達(dá)，其中，、等5個(gè)基因的表達(dá)可能與梨樹植株的高矮有關(guān)。

梨；ARF；轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】‘中矮1號(hào)’是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所選育的中國(guó)第一個(gè)優(yōu)良梨樹矮化砧木，其株型矮化緊湊，且具有使嫁接樹矮化、早果的作用[1]，在梨樹矮化密植栽培中發(fā)揮著重要作用，但其矮生和矮化機(jī)制尚不清楚，限制了新的矮生型品種和矮化砧木的選育及改良。植株高矮與莖的伸長(zhǎng)緊密相關(guān)，生長(zhǎng)素是調(diào)節(jié)植物莖伸長(zhǎng)的重要激素之一，而植物對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)受許多基因的調(diào)控，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（auxin response factor，ARF）則是其中一類較為重要的調(diào)節(jié)基因，它能夠通過(guò)調(diào)節(jié)植物對(duì)生長(zhǎng)素的反應(yīng)而調(diào)控植株的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。因此，鑒定梨基因組中轉(zhuǎn)錄因子成員并分析其結(jié)構(gòu)及其在矮生梨樹不同組織器官中的表達(dá)規(guī)律，將有助于解析該家族基因在矮生梨樹中的作用機(jī)制，同時(shí)，也為進(jìn)一步克隆梨樹和研究其在生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中的作用奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素反應(yīng)是通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，它可以與植物生長(zhǎng)素反應(yīng)基因啟動(dòng)子上的生長(zhǎng)素反應(yīng)元件（auxin response elements，AuxRE）TGTCTC特異結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的表達(dá)[4]。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子是以基因家族的形式存在的，是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的[5]，繼而在擬南芥中共鑒定出23個(gè)[6]，隨著越來(lái)越多植物基因組測(cè)序的完成，很多大田作物、蔬菜和果樹中的也已經(jīng)被鑒定出來(lái)，如玉米中鑒定出31個(gè)[7]，水稻25個(gè)[8]，大豆51個(gè)[9]，番茄17個(gè)[10]，黃瓜18個(gè)[11]，葡萄19個(gè)[12]，蘋果29個(gè)[13]，甜橙19個(gè)[14]，番木瓜11個(gè)[15]，香蕉47個(gè)[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】梨基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的發(fā)布已使梨基因組中的分離與鑒定成為可能[17]，但還未見相關(guān)研究報(bào)道，尤其缺少不同的表達(dá)與植株高矮關(guān)系的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定梨基因組中所有，以明確該家族基因在梨樹中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與進(jìn)化特征，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因家族成員在梨樹不同組織器官和不同品種中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究其在梨樹矮生性狀形成過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料‘中矮1號(hào)’（矮生）、‘錦香’（半矮生，‘中矮1號(hào)’母本）及‘早酥’（非矮生），樹齡20年以上，基砧均為杜梨（Bge.），每個(gè)品種3株。分別于2016年4月27日采集‘中矮1號(hào)’的花（每花序只采集1朵邊花）和根（基砧杜梨），6月21日采集上述3個(gè)品種新梢頂部幼葉、新梢中部的韌皮部和木質(zhì)部（每個(gè)單株采集新梢3個(gè)，摘除葉片，剪去枝條基部和頂部幼嫩處，將韌皮部和木質(zhì)部分離，分別迅速剪碎混勻），6月30日采集‘中矮1號(hào)’的果實(shí)（每個(gè)單株采集果實(shí)3個(gè)，切成小塊混勻），錫箔紙包裹，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中待用。

1.2 梨基因組中ARF家族基因鑒定

由于梨與蘋果均屬于薔薇科仁果類果樹，二者親緣關(guān)系較近，因此，本研究以蘋果和模式植物擬南芥中已鑒定出的ARF序列為誘餌，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）對(duì)梨基因組（taxid:225117）進(jìn)行定向tblastn檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇RefSeq RNA，從而獲得梨候選的mRNA、蛋白和對(duì)應(yīng)的基因序列。利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和PROSITE（http://prosite.expasy.org/）在線軟件對(duì)候選基因的蛋白序列進(jìn)行分析，以確定其含有所特有的Auxin_resp保守結(jié)構(gòu)域。

1.3 梨ARF蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域及保守元件分析

利用本地軟件DNAMAN v6、在線軟件WebLogo 3（http://weblogo.threeplusone.com/）和MEME Suite 4.11.1（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)梨ARF蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域和保守元件進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.4 梨ARF蛋白的進(jìn)化分析

以獲取的梨ARF蛋白序列和文獻(xiàn)報(bào)道的蘋果、葡萄和擬南芥等植物的ARF蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用NJ 方法（執(zhí)行參數(shù)：bootstrap：1 000次重復(fù)、Poission model和pairwise deletion）。

1.5 梨ARF的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)BLAST鑒定獲得梨的CDS序列和對(duì)應(yīng)的基因序列，采用在線軟件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)其進(jìn)行內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)分析。

1.6 梨ARF表達(dá)分析

將1.1中采自不同單株的相同樣品等量均勻混合研磨，以Plantol高效總RNA提取試劑盒（深圳萊伯克生物科技有限公司）提取各樣品的總RNA，使用DNaseⅠ（大連寶生物科技有限公司）去除總RNA中的DNA，用Prime ScriptTMRT reagent Kit（大連寶生物科技有限公司）對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR?Premix ExTMⅡ（大連寶生物科技有限公司）進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，試驗(yàn)過(guò)程均按各試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行。RT-qPCR反應(yīng)采用20 μL體系：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，正、反向引物各1 μL（10 mmol·L-1），cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃，5 min；95℃，30 s；55—60℃（表1），30 s；72℃，30 s，32個(gè)循環(huán)。以（GU830958.1）為內(nèi)參，所用引物見表1。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，采用DPS 7.05軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 qPCR所用引物序列及退火溫度

2 結(jié)果

2.1 梨基因組中ARF家族基因鑒定

根據(jù)蘋果和擬南芥ARF蛋白的序列信息，在梨基因組中檢索，并通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析去除不含Auxin_resp結(jié)構(gòu)域的基因，最終共獲得31個(gè)梨，為了便于后續(xù)分析，將其以—的方式進(jìn)行命名，其中，將同一基因位點(diǎn)出現(xiàn)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體視為同一基因，后續(xù)分析時(shí)僅以轉(zhuǎn)錄變異體（transcript variant）X1對(duì)應(yīng)的序列作為該基因的代表。分析表明，的長(zhǎng)度在587—1 154 aa，分子量在64.78—128.88 kD，等電點(diǎn)在5.07—7.82（表2），除和、和等2對(duì)序列完全相同外，其他序列均各不相同。

表2 梨ARF

aNCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的mRNA序列編號(hào)；b類生長(zhǎng)素反應(yīng)因子2轉(zhuǎn)錄變異體

aThe accession number of predicted mRNA sequence from NCBI`s GenBank database;bAuxin response factor 2-like transcript variant

2.2 梨ARF結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)SMART和PROSITE在線軟件對(duì)所獲得的蛋白序列進(jìn)行檢索分析，所有候選蛋白的N端除含有1個(gè)AFR蛋白所特有的Auxin_resp結(jié)構(gòu)域外，還含有1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，除PbARF11、12、24、25和26外，其他序列的C末端還存在一個(gè)PB1（AUX_IAA）結(jié)構(gòu)域。通過(guò)DNAMAN比對(duì)和Weblogo在線分析，發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)結(jié)構(gòu)域在梨中高度保守。其中，B3結(jié)構(gòu)域中有40個(gè)氨基酸在所有序列中是完全保守的，約占結(jié)構(gòu)域總長(zhǎng)度（103 aa）的38.8%；Auxin_resp結(jié)構(gòu)域中有9個(gè)氨基酸在所有序列中是完全保守的，約占結(jié)構(gòu)域平均長(zhǎng)度（83 aa）的10.8%；PB1結(jié)構(gòu)域中有10個(gè)氨基酸在含有該結(jié)構(gòu)域的序列中是完全保守的，約占結(jié)構(gòu)域平均長(zhǎng)度（83 aa）的12.0%（圖1）。

利用在線軟件MEME對(duì)梨ARF蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，梨ARF蛋白含有15個(gè)保守元件。其中，元件1、2和10屬于B3結(jié)構(gòu)域，它們與元件3和元件5共同構(gòu)成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；元件6、7、8和14屬于Auxin_resp結(jié)構(gòu)域；元件4、9和15屬于PB1結(jié)構(gòu)域；元件11、12和13為未知結(jié)構(gòu)域。除PbARF18缺失元件3和5外，所有序列均含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5個(gè)元件和Auxin_resp結(jié)構(gòu)域4個(gè)元件中的至少3個(gè)元件（PbARF5—8缺失元件8，PbARF24—31缺失元件14）。PbARF1—10和13—23含有PB1結(jié)構(gòu)域中的所有3個(gè)元件，而PbARF11和12則缺失了其中的元件4和9，PbARF27—31則缺失了其中的元件15，PbARF27—28除缺失元件15外，還缺失元件4。此外，除PbARF11和12外，所有序列均含有未知元件11，而未知元件12僅在PbARF24和25—31中出現(xiàn)，未知元件13只在PbARF13和15—24中出現(xiàn)（圖2）。

2.3 梨ARF蛋白的進(jìn)化分析

利用MEGA5.05軟件對(duì)本研究獲得的31個(gè)梨及文獻(xiàn)報(bào)道的29個(gè)蘋果[13]、19個(gè)葡萄[12]和23個(gè)擬南芥[6]的共102個(gè)AFR氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果表明，所有102個(gè)ARF成員可以被清晰分成4組：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ和ClassⅣ，每組中都含有上述4個(gè)物種中的成員。其中，PbARF1—8等8個(gè)成員在ClassⅠ中，PbARF9—12等4個(gè)成員在ClassⅡ中，PbARF13—23等11個(gè)成員在ClassⅢ中，PbARF24—31等8個(gè)成員在ClassⅣ中。在所有31個(gè)PbARF中，除PBARF19、20、27和28等4個(gè)成員外，其他成員均能在蘋果中找到與其配對(duì)的同源序列，蘋果中也僅有MdARF1、4、5和14等4個(gè)成員在梨中沒(méi)有與其配對(duì)的同源序列。在ClassⅠ中，AtARF12—15、20—23等8個(gè)擬南芥成員單獨(dú)聚在一個(gè)小分支上，在梨、蘋果和葡萄等其他3種果樹中均未發(fā)現(xiàn)與其高度同源的序列（圖3）。

所有保守元件（Motif 1—15）都是利用在線軟件MEME檢索梨ARF蛋白序列獲得，不同顏色矩形塊的長(zhǎng)度和排列順序代表各保守元件在蛋白序列上的實(shí)際大小和分布位置

2.4 梨ARF的內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)分析

對(duì)獲得的31個(gè)PbARF蛋白序列進(jìn)行了進(jìn)一步的進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白也可以被清晰的聚為4組，這與圖3的分組結(jié)果基本一致，只是不同組間的進(jìn)化關(guān)系略有不同。對(duì)獲得的的CDS序列和對(duì)應(yīng)的基因序列采用在線軟件GSDS2.0（http:// gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)家族基因外顯子的數(shù)量在2—15，其中ClassⅣ成員的外顯子數(shù)量最少，僅為2—3個(gè)，ClassⅡ成員的外顯子數(shù)量為11—12，ClassⅠ和ClassⅢ成員的外顯子數(shù)量多為14個(gè)，僅個(gè)別成員為13或15個(gè)（圖4）。

該進(jìn)化樹是利用MEGA5軟件采用NJ方法構(gòu)建的，bootstrap測(cè)驗(yàn)采用1 000次重復(fù)，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表分枝的可信度，不同分組ARF蛋白的分枝顏色不同

2.5 梨ARF表達(dá)分析

運(yùn)用熒光定量PCR的方法對(duì)基因家族成員在矮生梨品種‘中矮1號(hào)’不同組織器官中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。由于和和和和等4對(duì)基因的序列相同或或高度相似，難以設(shè)計(jì)特異表達(dá)引物加以區(qū)分，因此，表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果的是1對(duì)基因的共同表達(dá)量。組織表達(dá)結(jié)果表明，所檢測(cè)的基因家族成員幾乎在‘中矮1號(hào)’所有組織中均有表達(dá)。其中，相對(duì)于其他成員基因表達(dá)量較低；和在果實(shí)中的表達(dá)量相對(duì)高于其他組織；在花中的表達(dá)量相對(duì)高于其他組織；等7個(gè)成員則在木質(zhì)部中的表達(dá)量相對(duì)較高，除在木質(zhì)部中表達(dá)相對(duì)較高外，在韌皮部中的表達(dá)量也相對(duì)較高（圖5）。

進(jìn)化樹的構(gòu)建方法同圖3；內(nèi)含子和外顯子分布結(jié)構(gòu)圖由在線軟件GSDS2.0生成，矩形塊的長(zhǎng)度代表其實(shí)際的序列長(zhǎng)度

進(jìn)一步比較基因家族成員在‘早酥’（喬化）、‘錦香’（‘中矮1號(hào)’母本，半矮化）和‘中矮1號(hào)’（矮化）等3個(gè)梨品種木質(zhì)部和韌皮部中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，不同在3個(gè)品種韌皮部和木質(zhì)部中的表達(dá)各有高低，多無(wú)明顯規(guī)律，僅在3個(gè)品種韌皮部中的表達(dá)表現(xiàn)為植株越矮表達(dá)量越高的趨勢(shì)，等4個(gè)基因在3個(gè)品種木質(zhì)部中的表達(dá)表現(xiàn)為植株越矮表達(dá)量越低的趨勢(shì)（圖6）。

3 討論

隨著高通量測(cè)序和生物信息技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多物種的基因組序列已得到解析，使得從基因組層面上對(duì)某一家族基因進(jìn)行全面的鑒定和分析成為可能。ARF是生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其在基因組中即以家族的形式存在，分別調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的許多重要環(huán)節(jié)。ARF基因家族成員已在多個(gè)物種中被分離鑒定出來(lái)，但不同物種中ARF基因家族成員數(shù)量不同，本研究自梨基因組中鑒定出PbARF基因31個(gè)，與玉米[7]中的成員數(shù)量一致，比擬南芥、蘋果[6,8,10-15]等多個(gè)物種中的成員數(shù)量均多，但少于大豆（51個(gè)）[9]和香蕉（47個(gè)）[16]。雖然梨的數(shù)量與玉米中的數(shù)量一樣多，但其基因組大小為527 Mb[17]，遠(yuǎn)小于玉米的2 300 Mb[18]；雖然基因組大小與香蕉的523 Mb[19]接近，但數(shù)量卻比香蕉中的少的多。由此可見，在基因組中的數(shù)量多少不完全取決于基因組大小。有研究表明基因復(fù)制對(duì)基因家族的形成起著重要作用[20]，在蘋果中的研究即發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制、片段復(fù)制和全基因組復(fù)制對(duì)蘋果基因組的擴(kuò)展具有重要作用[13]。梨與蘋果同屬薔薇科果樹，ARF蛋白的進(jìn)化分析結(jié)果表明，二者的親緣關(guān)系較近，雖然梨基因組小于蘋果（742 Mb[21]），但二者ARF基因數(shù)量接近，僅各有4個(gè)ARF蛋白沒(méi)有形成互相配對(duì)的同源序列，其他成員均能在另一個(gè)基因組中找到與之配對(duì)的同源序列。因此，推測(cè)梨基因組中的進(jìn)化也經(jīng)歷了與蘋果類似的過(guò)程，但由于基因組大小和組成不同，個(gè)別基因的進(jìn)化過(guò)程和功能可能又略有不同。

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化和基因內(nèi)含子、外顯子組成結(jié)構(gòu)等分析，本研究中的PbARF蛋白可被劃分為4組，該分組結(jié)果與水稻、葡萄和甜橙等[8,12,19]的研究結(jié)果一致，與蘋果、玉米等[7,19]的研究結(jié)果略有不同，其不同的主要原因是他們對(duì)成員較多的組又進(jìn)行了細(xì)致劃分。但與梨一致的是，在其他物種中也有一個(gè)外顯子數(shù)量較少的分組，其他分組成員的外顯子數(shù)量均較多，可見，在外顯子和內(nèi)含子進(jìn)化上具有較大的一致性。

本研究鑒定的梨AFR蛋白多含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，1個(gè)AFR蛋白所特有的Auxin_resp結(jié)構(gòu)域、1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域和1個(gè)PB1結(jié)構(gòu)域，但PbARF11、12、24、25和26等5個(gè)成員僅有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，PB1結(jié)構(gòu)域缺失，與前人研究結(jié)果類似[22]。研究表明，B3結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性[23]，其可以與生長(zhǎng)素反應(yīng)基因啟動(dòng)子上的作用元件結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)與B3結(jié)構(gòu)域相連的Auxin_resp結(jié)構(gòu)域激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)[3]。PB1結(jié)構(gòu)域是一個(gè)介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)在生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中起抑制作用的AUX/IAA蛋白中也具有類似結(jié)構(gòu)域，2個(gè)蛋白可以通過(guò)該結(jié)構(gòu)域的互作而形成ARF-ARF、ARF-Aux/IAA和 Aux/IAA-Aux/IAA同源或異源寡聚體。當(dāng)生長(zhǎng)素濃度低時(shí)，ARF與Aux/IAA形成異源寡聚體，抑制生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的表達(dá)；當(dāng)生長(zhǎng)素濃度升高時(shí)，Aux/IAA蛋白被泛素化途徑降解，抑制作用解除[22]。但PbARF11、12、24、25和26等PB1結(jié)構(gòu)域缺失的ARF是否有類似的功能還有待進(jìn)一步研究。

熒光定量PCR表達(dá)分析結(jié)果表明，本研究中各在梨樹根、韌皮部、木質(zhì)部、葉、花和果實(shí)等不同組織器官中均可表達(dá)，在蘋果[13]和番茄[24]等作物上也獲得了類似結(jié)果。通過(guò)對(duì)擬南芥突變體的研究表明，可以對(duì)開花時(shí)間和花器官的質(zhì)量產(chǎn)生影響[25]，本研究中PbARF19—23與其處于同一進(jìn)化分枝，其中，即在花器官中具有相對(duì)較高的表達(dá)量，可能與具有類似的功能。對(duì)根冠的形成具有重要作用[26]，本研究中PbARF27—31與其處于較近的分枝上，在根中均具有相對(duì)較高的表達(dá)量，可能與根的發(fā)育相關(guān)。在側(cè)根的形成、根系和下胚軸的向重力性中起重要作用[27]，番茄中的同源基因則在花中具有較高的表達(dá)量，調(diào)控授粉受精過(guò)程[28]，本研究中PbARF17、18與AtARF7、19處于較近的分枝上，在花中均有相對(duì)較高的表達(dá)量，與番茄中的結(jié)果一致，其功能或許與擬南芥不同。

‘中矮1號(hào)’不僅自身矮化，其作中間砧對(duì)嫁接品種也具有矮化作用，而中間砧僅由木質(zhì)部和韌皮部?jī)刹糠纸M成，可見控制其矮化性狀的基因只能在木質(zhì)部和韌皮中起作用；前期研究結(jié)果表明，新梢停長(zhǎng)早是‘中矮1號(hào)’矮生的原因之一，6月中下旬是‘中矮1號(hào)’即將停長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期[29]。因此，本研究還于6月21日采集3個(gè)不同生長(zhǎng)勢(shì)梨品種新梢的木質(zhì)部和韌皮部，比較了在其中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)品種韌皮部中的表達(dá)表現(xiàn)為植株越矮表達(dá)量越高的趨勢(shì)，等4個(gè)基因在3個(gè)品種木質(zhì)部中的表達(dá)表現(xiàn)為植株越矮表達(dá)量越低的趨勢(shì)。PbARF16、17、18與AtARF7和AtARF19處于同一分枝，PbARF27、29與AtARF10和AtARF16處于較近分枝上，研究表明，上述基因在擬南芥中均可對(duì)根系的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[26-27]，其中，AtARF7和AtARF19功能有重疊，擬南芥和雙突變體具有側(cè)根發(fā)育嚴(yán)重缺陷和根及下胚軸向地性異常等表型，但各自的單突變體均無(wú)此表型[27]；番茄中的同源基因具有調(diào)控果實(shí)授粉受精的功能[28]；和也具有一定程度的功能冗余，他們均為microRNA160的靶基因，受其負(fù)調(diào)控，主要影響根冠的發(fā)育，同時(shí)，還在種子的萌發(fā)過(guò)程中起重要作用[30]，但均未見對(duì)植株高度影響的報(bào)道。盡管如此，由于梨樹是木本植物，與擬南芥和番茄等物種的差異極大，這些基因是否能夠影響梨樹植株的生長(zhǎng)還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

梨基因組中含有31個(gè)ARF基因家族成員；所有PbARF蛋白均含有Auxin_resp和B3等2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域；PbARF蛋白可以被劃分為4組，基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守；所有在‘中矮1號(hào)’不同組織器官及‘早酥’（喬化）、‘錦香’（‘中矮1號(hào)’母本，半矮化）和‘中矮1號(hào)’（矮化）3個(gè)梨品種的木質(zhì)部和韌皮部中均有表達(dá)，其中，等5個(gè)基因的表達(dá)可能與梨樹植株的高矮有關(guān)。

[1] 姜淑苓, 賈敬賢, 紀(jì)寶生, 馬力. 梨矮化砧木—中矮1 號(hào). 中國(guó)果樹, 2000(3): 1-3.

Jiang S L, Jia J X, Ji B S, Ma L. Pear dwarfing stocks-Zhongai 1., 2000(3): 1-3. (in Chinese)

[2] Vanneste S, Friml J. Auxin: a trigger for change in plant development., 2009, 136(6): 1005-1016.

[3] GUILFOYLE T J, HAGEN G. Auxin response factors., 2007, 10(5): 453-460.

[4] HAGEN G, GUILFOYLE T. Auxin-responsive gene expression: genes, promoters and regulatory factors., 2002, 49(3/4): 373-385.

[5] ULMASOV T, HAGEN G, GUILFOYLE T J. ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements., 1997, 276(5320): 1865-1868.

[6] REMINGTON D L, VISION T J, GUILFOYLE T J, REED J W. Contrasting modes of diversification in the Aux/IAA and ARF gene families., 2004, 135(3): 1738-1752.

[7] XING H Y, PUDAKE R N, GUO G G, XING G F, HU Z R, ZHANG Y R, SUN Q X, NI Z F. Genome-wide identification and expression profiling of auxin response factor (ARF) gene family in maize. BMC Genomics, 2011, 12(1): 178.

[8] WAN D K, PEI K M, FU Y P, SUN Z X, LI S J, LIU H Q, TANG K, HAN B, TAO Y Z. Genome-wide analysis of the auxin response factors (ARF) gene family in rice (Oryza sativa). Gene, 2007, 394(1): 13-24.

[9] HA C V, LE D T, NISHIYAMA R, WATANABE Y, SULIEMAN S, TRAN U T, MOCHIDA K, DONG N V, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K, SHINOZAKI K, TRAN L P. The auxin response factor transcription factor family in soybean: genome-wide identification and expression analyses during development and water stress. DNA Research, 2013, 20(5): 511-524.

[10] KUMAR R, TYAGI A K, SHARMA A K. Genome-wide analysis of auxin response factor (ARF) gene family from tomato and analysis of their role in flower and fruit development. Molecular Genetics and Genomics, 2011, 285(3): 245-260.

[11] 盛慧, 秦智偉, 李文濱, 周秀艷, 武濤, 辛明. 黃瓜生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(ARF)家族鑒定及表達(dá)特異性分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47(10): 1985-1994.

SHENG H, QIN Z W, LI W B, ZHOU X Y, WU T, XIN M. Genome-wide identification and expression analysis of auxin response factor (ARF) family in cucumber. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(10): 1985-1994. (in Chinese)

[12] WAN S B, LI W L, ZHU Y Y, LIU Z M, HUANG W D, ZHAN J C. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of the auxin response factor gene family in Vitis vinifera. Plant Cell Reports, 2014, 33(8): 1365-1375.

[13] 李慧峰, 冉昆, 何平, 王海波, 常源升, 孫清榮, 程來(lái)亮, 李林光. 蘋果生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARF)基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析. 植物生理學(xué)報(bào), 2015, 51(7): 1045-1054.

LI H F, RAN K, HE P, WANG H B, CHANG Y S, SUN Q R, CHENG L L, LI L G. Genome-wide identification and expression analysis of auxin response factor (ARF) gene family in apple. Plant Physiology Journal, 2015, 51(7): 1045-1054. (in Chinese)

[14] LI S B, OUYANG W Z, HOU X J, XIE L, HU C G, ZHANG J Z. Genome-wide identification, isolation and expression analysis of auxin response factor (ARF) gene family in sweet orange (Citrus sinensis). Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 119.

[15] LIU K D, YUAN C C, LI H L, LIN W H, YANG Y J, SHEN C J, ZHENG X L. Genome-wide identification and characterization of auxin response factor (ARF) family genes related to flower and fruit development in papaya (Carica papaya L.). BMC Genomics, 2015, 16(1): 901.

[16] HU W, ZUO J, HOU X W, YAN Y, WEI Y X, LIU J H, LI M Y, XU B Y, JIN Z Q. The auxin response factor gene family in banana: genome-wide identification and expression analyses during development, ripening, and abiotic stress. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 742.

[17] WU J, WANG Z W, SHI Z B, ZHANG S, MING R, ZHU S L,KHAN M A, TAO S T, KORBAN S S, WANG H, CHEN N J, NISHIO T, XU X, CONG L, QI K J, et al. The genome of the pear (Pyrus bretschneideri Rehd.). Genome Research, 2013, 23(2): 396-408.

[18] SCHNABLE P S, WARE D, FULTON R S, STEIN J C, WEI F S, PASTERNAK S, LIANG C Z, ZHANG J W, FULTON L, GRAVES T A, WILSON R K. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science, 2009, 326(5956): 1112-1115.

[19] D’HONT A, DENOEUD F, AURY J M, BAURENS F C, CARREEL F, GARSMEUR O, NOEL B, BOCS S, DROC G, ROUARD M, WINCKER P. The banana (Musa acuminata) genome and the evolution of monocotyledonous plants. Nature, 2012, 488(7410): 213-217.

[20] FLAGEL L E, WENDEL J F. Gene duplication and evolutionary novelty in plants., 2009, 183(3): 557-564.

[21] VELASCO R, ZHARKIKH A, AFFOURTIT J, DHINGRA A, CESTARO A, KAYANARAMAN A, FONTANA P, BHATNAGAR S K, TROGGIO M, PRUSS D, VIOLA R. The genome of the domesticated appleBorkh.)., 2010, 42(10): 833-839.

[22] GUILFOYLE T J. The PB1 domain in auxin response factor and Aux/IAA proteins: a versatile protein interaction module in the auxin response., 2015, 27(1): 33-43.

[23] SUZUKI M, KAO C Y, MCCARTY D R. The conserved B3 domain of VIVIPAROUS1 has a cooperative DNA binding activity., 1997, 9(5): 799-807.

[24] KUMAR R, TYAGI A K, SHARMA A K. Genome-wide analysis of auxin response factor (ARF) gene family from tomato and analysis of their role in flower and fruit development., 2011, 285(3): 245-260.

[25] NAGAL P, ELLIS C M, WEBER H, PLOENSE S E, BARKAWI L S , GUILFOYLE T J, HAGEN G, ALONSO J M, COHEN J D, FARMER E E, ECKER J R, REED J W. Auxin response factors ARF6 and ARF8 promote jasmonic acid production and flower maturation., 2005, 132(18): 4107-4118.

[26] WANG J W, WANG L J, MAO Y B, CAI W J, XUE H W, CHEN X Y. Control of root cap formation by microRNA-targeted auxin response factors in., 2005, 17(8): 2204-2216.

[27] OKUSHIMA Y, OVERVOORDE P J, ARIMA K, ALONSO J M, CHAN A, CHANG C, ECKER J R, HUGHES B, LUI A, NGUYEN D, ONODERA C, QUACH H, SMITH A, YU G X, Theologis A. Functional genomic analysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members in: unique and overlapping functions of ARF7 and ARF19., 2005, 17(2): 444-463.

[28] DE JONG M, WOLTERS-ARTS M, FERON R, MARIANI C, VRIEZEN W H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 () regulates auxin signaling during tomato fruit set and development., 2009, 57: 160-170.

[29] OU C Q, JIANG S L, WANG F, TANG C Y, HAO N N. An RNA-Seq analysis of the pearL.) transcriptome, with a focus on genes associated with dwarf., 2015, 4: 69-77.

[30] LIU P P, MONTGOMERY T A, FAHLGREN N, KASSCHAU K D, NONOGAKI H, CARRINGTON J C. Repression of AUXIN RESPONSE FACTOR10 by microRNA160 is critical for seed germination and post-germination stages., 2007, 52(1): 133-146.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Genome-wide Identification and Expression Analysis of() Gene Family in Pear

OU ChunQing, JIANG ShuLing, WANG Fei, ZHAO YaNan

(Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】The objectives of this research are to identify the auxin response factor (ARF) family genes from pear ()genome, to know the profile offamily such as gene number, gene structure and tissue expression in pear, and to provide theoretical basis for revealing what roles theplay in auxin signaling pathway and in growth and development of dwarf pear.【Method】genes in pear genome were identified by BLAST software based ongenes from apple and. SMART, PROSITE, WebLogo 3, DNAMAN 5, MEME, GSDS 2 and MEGA 5.1 software were used for bioinformatics analysis of ARF protein and gene sequences. The qPCR method was used to detect the relative expression ofgenes in different tissues of dwarf pear ‘Zhongai 1’ and in xylem and phloem of 3 pear cultivars with different growth vigor.【Result】Total of 31genes were identified from pear genome. All the PbARFs contain two domains of Auxin_resp and B3, and except for PbARF11, 12, 24, 25 and 26, the rest also contain a PB1 domain. Conservative motif analysis result showed that there are 15 motifs in PbARFs, but not every PbARF protein contains all the motifs. The PbARFs were divided into four classes based on phylogenetic analysis. Gene structure analysis result showed that there are 2-15 exons ins, The gene structure ofis high conservative. The qPCR result showed that all thegenes were expressed in the root, phloem, xylem, leaf, flower and fruit of ‘Zhongai 1’ pear and the expression pattern was various. The relative expression of,,,in the xylem of 3 pear cultivars showed that the more dwarf the plant, the lower the expression.【Conclusion】Auxin response factor family in pear contains 31 genes. All the 31 PbARF proteins contain both of Auxin_resp and B3 conservative domains, and were divided into four classes. The gene structure ofis high conservative. All the 31s were expressed in different tissues of ‘Zhongai 1’, root of rootstockand in phloem and xylem of 3 cultivars. Thereinto, the expression of,,,,may be relevant to pear plant height.

pear; ARF; transcription factor; bioinformatics; gene expression

2017-06-26；

2017-09-12

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013D02B01，2013BAD01B04-23）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2016-RIP）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（Y2016CG19 1610032012006）、遼寧省果樹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（LNGSCYTX-15-X）

歐春青，E-mail：ochunqing@163.com。

姜淑苓，E-mail：jshling@163.com