珠 娜，李 勇

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191)

核桃美味且營養(yǎng)豐富，其對心血管疾病、冠心病及神經(jīng)失調(diào)的有益作用已獲得學(xué)術(shù)界公認(rèn)[1-6]。核桃蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，含有人體必需的8種必需氨基酸，與動物蛋白質(zhì)相近，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源[8]。然而，與核桃蛋白質(zhì)相比，其水解產(chǎn)物核桃肽具有高濃度、低粘度，溶解性好，還原能力強(qiáng)及對pH變化相對穩(wěn)定等良好的特性，在起泡性、乳化性及吸油性等方面也優(yōu)于核桃蛋白，逐漸成為研究熱點(diǎn)[9-12]。

1 核桃肽的制備

目前，多肽的制備方法主要有水解法(酸水解、堿水解、酶水解)、分離提取法、化學(xué)合成法、基因重組法、微生物發(fā)酵法。分離提取法因受到食物多肽含量的限制，其得率和生產(chǎn)率不理想?；瘜W(xué)合成法主要用于制備短肽，其成本高、副反應(yīng)多?；蛑亟M法主要是制備較大的肽段，但其相關(guān)技術(shù)尚未成熟。微生物發(fā)酵法能合理利用資源是最為經(jīng)濟(jì)的方法，但是對微生物的選擇有著嚴(yán)格的要求，且要考慮安全問題。相比之下，酶水解法因其反應(yīng)條件溫和、酶的專一性高、產(chǎn)品純度高、水解效率高等優(yōu)點(diǎn)成為制備多肽的主要方法。核桃肽的制備也主要用酶水解法。酶水解法對酶的專一性有較高的要求，對多肽的制備至關(guān)重要。核桃肽的制備中常用的酶有中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。此外，也有許多研究證實(shí)，復(fù)合酶的水解作用更強(qiáng)，可提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率[13-14]。

多肽的制備過程中，酶解條件起著重要的作用，與多肽的功能及生物活性密切相關(guān)。適度的延長反應(yīng)時間會使酶和底物充分反應(yīng)，但一定時間后水解度的增加并不明顯[14]。劉昭明等[15]采用正交試驗(yàn)制備核桃蛋白的中性蛋白酶水解肽，發(fā)現(xiàn)溫度40℃、底物4%、加酶量4 000U/g、pH 8.0時其水解度最佳。包怡紅等[16]以風(fēng)味蛋白酶為酶制劑水解核桃蛋白，發(fā)現(xiàn)溫度55℃、底物10%、加酶量1.5%、pH 6.5、反應(yīng)時間2h時其水解度最佳。劉威等[17]采用堿性蛋白酶水解核桃清蛋白，其最佳酶解條件為溫度45℃、底物4%、加酶量8 000U/g、pH 9.5、反應(yīng)時間2h。李艷伏等[18]以木瓜蛋白酶水解核桃蛋白在溫度55℃、底物3%、加酶量6 000U/g、pH 7.5、反應(yīng)時間3.5h時獲得了具有抗氧化功能的核桃肽。

2 核桃肽的生物活性

2.1 核桃肽的抗氧化活性研究

生物活性肽的抗氧化活性與其氨基酸序列有關(guān)，用特異性蛋白水解酶可以制備抗氧化肽段[17，19-20]。核桃多肽抗氧化方面的動物實(shí)驗(yàn)研究較少，主要涉及體外試驗(yàn)，檢測其清除二苯代苦味酰基自由基(DPPH)，羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)、ABTS+·自由基的清除能力[21]及總抗氧化能力、Fe2+螯合能力、亞油酸過氧化能力[22]。劉威等[17]用堿性蛋白酶水解核桃清蛋白，在pH 9.5、溫度45℃、底物濃度4%、加酶量8 000U/g的條件下水解2.5h，獲得抗氧化活性肽并證實(shí)其對·OH、DPPH·、ABTS+·3種自由基的清除能力及對Fe2+的螯合能力。李艷伏等[18]在6 000U/g底物、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、pH 7.5、溫度55℃的酶解條件下用木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白，發(fā)現(xiàn)210min時酶解液的抗氧化活性較高，OH·清除率為55.43%，O2-·清除率為64.23%，DPPH·清除率為79.32%，總抗氧化能力為98.74%單位/mL。而且，確定具有抗氧化功能的多肽分子質(zhì)量主要集中在1 321～607Da之間。郝常艷等[14]用中性蛋白酶在酶濃度9 999.99U/g、底物濃度10%、溫度50.07℃、pH 7.21的酶解條件下水解核桃蛋白所得到的抗氧化活性肽進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)核桃肽可以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)過氧化物歧化酶(GXH-Px)活性、降低丙二醛(MDA)含量。通過體外試驗(yàn)及體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)可以證明核桃肽具有良好的抗氧化活性。

2.2 核桃肽的降血壓活性研究

20世紀(jì)60年代中，F(xiàn)erria等[23-24]從西蝮蛇毒液中首次提取出具有降壓活性的寡肽，命名為舒緩激肽增強(qiáng)肽。后來研究者根據(jù)該寡肽的降壓原理合成了第一個口服降壓藥卡托普利[25]。降壓活性肽的研究越來越受研究者的關(guān)注，且隨著藥食同源的提出，降血壓活性肽主要來源于食源性物質(zhì)，其安全性高、作用溫和，而且對正常人沒有降壓作用。降壓活性肽主要是通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)達(dá)到降壓的目的。血管緊張素原被腎素水解產(chǎn)生血管緊張素Ⅰ，進(jìn)一步在ACE的作用下轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ發(fā)揮收縮血管的作用。降壓活性肽抑制ACE，阻斷后續(xù)一系列反應(yīng)，從而起到降壓作用，因此又被稱為ACE抑制肽[26-27]。食物源性ACE抑制肽有很多，舒國偉等[28]以羊乳為原料，發(fā)酵法和酶解法制備出了羊乳源性ACE抑制肽。Shin等[29]將大豆蛋白中分離出的活性肽注射給自發(fā)性高血壓大鼠，發(fā)現(xiàn)可以顯著降低收縮壓。

ACE抑制肽的活性檢測方法有體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)包括紫外分光光度法、熒光分光光度法、高效液相色譜法。體外試驗(yàn)主要是通過對自發(fā)性高血壓大鼠給予ACE抑制肽，比較干預(yù)前后血壓變化來評價其活性大小[26]。目前，尚無核桃肽降血壓的體內(nèi)試驗(yàn)的研究報道，其活性研究主要是體外試驗(yàn)。姜莉等[30]在酶用量6 000U/g、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、pH 7.5、溫度50℃的酶解條件下，木瓜蛋白酶水解核桃蛋白240min，發(fā)現(xiàn)酶解液的ACE抑制率較高達(dá)88.86%。劉猛等[31]發(fā)現(xiàn)，以制油后的核桃渣為原料，將其用中性蛋白酶水解，并進(jìn)一步超濾、凝膠過濾層析、離子交換層析、高效液相色譜法分離提取的活性肽有顯著的降壓活性。

2.3 核桃肽提高免疫活性研究

食物與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)，食物所提供的某些活性營養(yǎng)物質(zhì)可以調(diào)節(jié)免疫功能，例如紫菜、香菇等[32-36]。近年來，有許多研究報道，食物蛋白水解物-肽有良好的免疫調(diào)節(jié)作用。許丹等[37]發(fā)現(xiàn)，牡蠣肽可以改善免疫抑制小鼠的免疫系統(tǒng)紊亂[37]。楊睿悅等[38]發(fā)現(xiàn)，海參蛋白肽可以增強(qiáng)小鼠免疫功能。這些生物活性肽被稱之為免疫調(diào)節(jié)肽，其免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制尚不清楚，一般是通過增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖和抗體生成達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的[39-41]。核桃蛋白作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，研究發(fā)現(xiàn)，其水解物核桃肽也有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。李漢洋等[42]發(fā)現(xiàn)，核桃多肽對小鼠淋巴細(xì)胞有增殖作用。崔玲玉等[43]研究發(fā)現(xiàn)，山核桃蛋白及其水解物均提高胸腺和脾臟指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、脾臟T淋巴細(xì)胞增值能力、增加小腸內(nèi)容物IgA的濃度，顯著增強(qiáng)小鼠免疫功能。崔犁等[44]發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白中性蛋白酶水解物可以增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖及其分泌白細(xì)胞介素-2、巨噬細(xì)胞功能及其產(chǎn)生NO的功效。

2.4 核桃肽抗疲勞活性研究

疲勞的產(chǎn)生機(jī)制主要涉及能源物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的堆積、自由基的氧化損傷、離子代謝的紊亂以及大腦的保護(hù)性抑制等方面[45-47]?；谄诘漠a(chǎn)生機(jī)制，可以從延緩疲勞的產(chǎn)生、促進(jìn)疲勞的消除兩方面考慮，采用藥物手段、鍛煉方法手段及營養(yǎng)的手段來達(dá)到抗疲勞的目的。其中，營養(yǎng)手段因安全、有效、無毒副作用而備受關(guān)注[48]。生物活性肽的抗疲勞功能是公認(rèn)的，有研究報道，玉米肽、小麥肽、大豆小分子肽、海參肽、人參肽、蠶蛹蛋白多肽等均有抗疲勞作用[49-53]。賈靖霖等[54]通過小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)核桃肽顯著延長小鼠負(fù)重游泳力竭時間、降低血乳酸及尿素氮含量、升高肌糖原和肝糖原的儲備。段心妍等研究發(fā)現(xiàn)，核桃肽干預(yù)SD大鼠可延長其力竭游泳的時間，加速肌肉中乳酸的代謝，減少血尿素氮的產(chǎn)生，提高血紅蛋白的再生能力等。

2.5 核桃肽改善學(xué)習(xí)記憶活性研究

學(xué)習(xí)記憶的減退與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、自由基損傷、學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦突觸可塑性的改變、信使分子的濃度過高、中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放減少等有關(guān)[55-57]。Hicyilmaz等[58]發(fā)現(xiàn)，核桃可以對認(rèn)知功能的下降起保護(hù)作用，其機(jī)制主要涉及調(diào)節(jié)海馬中的N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)和脂質(zhì)過氧化水平。陳亮等[59]研究發(fā)現(xiàn)，核桃油可提高大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與乙酰膽堿能系統(tǒng)有關(guān)。樊永波等[60]發(fā)現(xiàn)，精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量較高的核桃蛋白也是核桃增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能的有效成分。核桃肽富含谷氨酸及瓜氨酸，前者屬于腦內(nèi)信號傳導(dǎo)有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，后者是信使NO的前體物質(zhì)，此外，核桃肽有較強(qiáng)的抗氧化活性，均對學(xué)習(xí)記憶有積極的改善作用。Li等[61]研究顯示，核桃肽對東莨菪堿所致的學(xué)習(xí)記憶障礙有保護(hù)作用，并發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與乙酰膽堿受體的顯著增加有關(guān)。Zou等[62]發(fā)現(xiàn)，核桃肽可以通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，減輕炎癥反應(yīng)，從而對阿爾茨海默癥小鼠起到保護(hù)作用。

2.6 核桃肽對代謝紊亂性疾病的調(diào)節(jié)活性研究

代謝紊亂主要與營養(yǎng)物質(zhì)的供需不平衡及吸收、消化、代謝障礙有關(guān)。研究表明，將核桃肽加入到釀酒酵母培養(yǎng)液可增加其對葡萄糖的利用，核桃肽干預(yù)STZ造模的2型糖尿病小鼠，可降低其血糖水平，且效果接近于二甲雙胍，同時降低血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平，改善糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的糖脂代謝紊亂，改善心、肝、腎等臟器的病變[63]。核桃肽還有調(diào)節(jié)血脂代謝的活性。楊子明等[64]采用D-半乳糖建立小鼠亞急性衰老模型，測定小鼠血脂水平，結(jié)果表明，與衰老模型組小鼠比較，植物蛋白水解專用酶制得的核桃多肽組能夠降低TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，堿性蛋白酶制得的核桃多肽組能夠使高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量升高。此外，也有研究者發(fā)現(xiàn)，核桃肽還可以改善尿酸代謝的紊亂。該研究顯示，胡桃粉水解物和脫酚核桃粕水解物能有效降低氧化鉀致高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，保護(hù)腎功能，并能抑制黃嘌呤氧化酶[65]。

2.7 核桃肽抗腫瘤活性研究

在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，膳食營養(yǎng)因素起著重要作用。近年來，隨著功能性食品的研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)食品中的一些蛋白質(zhì)成分具有抗癌功效，例如乳蛋白、螺旋藻蛋白、苦瓜蛋白、大豆蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，核桃仁蛋白木瓜酶水解物具有明顯的抑制細(xì)胞生長作用(IC50值為1.62mg/mL)。核桃仁蛋白木瓜酶水解物對人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)及人宮頸癌細(xì)胞(Hela)也具有明顯的抑制生長作用(IC50值分別為2.04、2.21mg/mL)[66-68]。核桃肽對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)也具有抑制作用。用木瓜蛋白酶制備核桃仁蛋白酶水解物，研究其對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)增殖的影響，結(jié)果顯示，水解物具有明顯的抑制細(xì)胞生長作用，IC50值為1.62mg/mL，研究不同分子量范圍的核桃肽組分對MCF-7細(xì)胞增殖影響的結(jié)果表明，MW<3k Da的低分子量組分具有較強(qiáng)的增殖抑制作用[69-70]。

2.8 核桃肽的其他生物活性作用

核桃仁蛋白酶水解物對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，且隨著水解度的增加，酶解物的抑菌能力增強(qiáng)[71]；研究者以體外乙醇脫氨酶激活能力為指標(biāo)，初步判斷核桃活性肽可能具有解酒效果，通過對不同肽段氨基酸含量的測定，得出活性較高的5-10KDa肽段中的谷氨酸和丙氨酸略高于其他肽段，但無顯著差異(P>0.05)[72]；酶作為生物體內(nèi)最重要的功能組分之一，數(shù)量巨大，種類極多，用于調(diào)控各種生理活動，在整個生命活動中起著不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白的酶解產(chǎn)物具有較明顯的絲氨酸蛋白酶水解活性。核桃蛋白的胃蛋白酶酶解產(chǎn)物具有纖維蛋白原水解活性及一定的溶血活性，溶血率為47.49%，而胰蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的溶血活性，溶血率高達(dá)199.33%[73]?！?/p>