孟紅旭 姚明江 任鈞國(guó) 劉建勛

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京,100091)

延胡索又名元胡、玄胡索等，為罌粟科紫堇屬植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖，具有活血、行氣、鎮(zhèn)痛等功用，用于胸脅、脘腹疼痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻等，現(xiàn)在臨床主要集中用于心律失常、冠心病心絞痛、氣滯血瘀諸痛[1-4]。目前認(rèn)為延胡索主要活性部位分是延胡索堿，主要分為叔胺堿和季胺堿。研究報(bào)道叔胺堿和季胺堿房性早搏、交界性早搏具有較好的治療作用，并發(fā)現(xiàn)叔胺堿與奎尼丁對(duì)心電圖的影響頗為相似，而季胺堿能夠產(chǎn)生與乙胺碘呋酮相似的作用，這表明這2種生物堿在抗心律失常方面具有不同的作用特點(diǎn)，雖然后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)延胡索堿的一些單體化合物對(duì)心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位和鉀通道產(chǎn)生一些效應(yīng)，但是延胡索堿的抗心律失常機(jī)制仍不清楚[5-6]，本研究通過觀察叔胺堿和季胺堿對(duì)豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位和HERG通道的影響從對(duì)離子通道角度探討叔胺堿和季胺堿的作用機(jī)制和作用特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年豚鼠(300 g)，由北京斯克貝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供(合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0004)。

1.1.2 藥物 季胺堿(中國(guó)科學(xué)院大連化物所饋贈(zèng),批號(hào)：20140821，總堿含量>90%)和叔胺堿(中國(guó)科學(xué)院大連化物所饋贈(zèng),批號(hào)：20140821總堿含量>60%)和特非那定(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S0425A)。

1.1.3 試劑與儀器 無鈣臺(tái)式液(mmol/L)：NaCl140，KCl 5.4，NaH2PO4 0.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(用NaOH調(diào)節(jié)至PH7.4)；KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(用KOH調(diào)節(jié)至PH7.4)；測(cè)定動(dòng)作電位電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140，Na2ATP 4，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，Glucose 10(用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2)；測(cè)定HERG電流電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 130，MgCl21，MgATP 5，EGTA 5，HEPES 10，glucose 10(用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.2)，除指定藥品外全部從Sigma-Aldrich中國(guó)公司購入。(PULL-100美國(guó))和膜片鉗放大器(HEKA EPC10德國(guó))。

1.1.4 豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離 豚鼠用20%烏拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速開腹取下心臟，在0 ℃無鈣臺(tái)式液的冰水混合液中去除脂肪以及多余組織，經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管將心臟置于Langendorff灌流裝置。用無鈣臺(tái)式液灌流心臟3～5 min，再用含酶(膠原酶Ⅰ0.3 g/L+蛋白酶E 0.1 g/L+牛血清白蛋白0.8 g/L)無鈣臺(tái)式液灌流1 min后，改成酶液環(huán)灌流4 min。剪下心室肌，在KB液中剪碎并輕輕吹打，用200目篩網(wǎng)過濾，貯存于4 ℃冰箱中待用。整個(gè)過程保持流入心臟的液體溫度為37 ℃，同時(shí)保證離體心臟的暴露環(huán)境溫度在22 ℃以上，各液體始終通以99.5%醫(yī)用氧氣。

1.2 方法

1.2.1 HERG-HEK293細(xì)胞的培養(yǎng) 將轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)人源心肌HERG離子通道的HEK293細(xì)胞(河北醫(yī)科大學(xué)藥理室提供)復(fù)蘇后接種于玻璃片上置于培養(yǎng)皿中，采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。HERG通道蛋白由GFP熒光蛋白標(biāo)記，在藍(lán)色熒光激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，誘導(dǎo)出的電流能夠被特非那定(1 μmol/L)阻斷，證明為穩(wěn)定表達(dá)HERG離子通道。見圖3。

1.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄 取一滴心室肌細(xì)胞懸液，置于倒置顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上的1 mL浴槽內(nèi)，靜置5 min使細(xì)胞充分貼附于浴槽底部，然后用臺(tái)式液進(jìn)行灌流，流速為2 mL/min，5 min后選擇邊緣整齊、橫紋清晰、表面光潔、靜止的桿狀心室肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)玻璃片直接置于細(xì)胞槽內(nèi)，然后用臺(tái)式液(CaCl22.0 mmol/L)進(jìn)行灌流，選擇三角形，折光性好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作微操使玻璃微電極接觸細(xì)胞膜負(fù)壓形成高阻抗封接(兆歐封接)，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄狀態(tài)。在PULSE軟件控制下，數(shù)字脈沖經(jīng)D/A轉(zhuǎn)換成模擬電壓或電流信號(hào)，再經(jīng)膜片鉗放大器放大，通過Ag-AgCl電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流或電壓信號(hào)經(jīng)膜片鉗放大器輸出，再經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換，由計(jì)算機(jī)采集整理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)在22 ℃室溫下進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 季胺堿和叔胺堿對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響 膜片鉗放大器在電流鉗模式下記錄單個(gè)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位，給予細(xì)胞刺激電流(強(qiáng)度400～900 pA，持續(xù)10～35 ms)引發(fā)動(dòng)作電位。給予叔胺堿(3、10 mg/L)后，動(dòng)作電位未見明顯變化(n=3)(圖1A),給予叔胺堿(30、100 mg/L)可見動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長(zhǎng)，洗脫后部分恢復(fù)，靜息電位和動(dòng)作電位幅度未見明顯變化(圖1B)。測(cè)定ADP90(復(fù)極至90%動(dòng)作電位時(shí)程)，將叔胺堿與灌流臺(tái)式液(對(duì)照)指標(biāo)進(jìn)行比較，計(jì)算ADP90延長(zhǎng)率(ADP90叔-ADP90臺(tái)/ADP90臺(tái))，叔胺堿(30、100 mg/L)ADP90的延長(zhǎng)率分別為(10.8±9.2)%(n=5)、(35.3±22.3)%(n=5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明叔胺堿延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程具有濃度依賴性。給予季胺堿(1、3 mg/L)后，動(dòng)作電位時(shí)程出現(xiàn)縮短，靜息電位變深，動(dòng)作電位幅度未見明顯變化(n=4)(圖2C);靜息電位由(-68.2±10.5)mV變?yōu)?-71.1±11.1)mV(n=4,P<0.05)和(81.5±13.8)mV(n=4,P>0.05)。給予10 mg/L季胺堿(n=2)后對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程未見明顯改變，給予季胺堿(30、100 mg/L)可見動(dòng)作電位時(shí)程明顯延長(zhǎng)，洗脫后部分恢復(fù)，靜息電位和動(dòng)作電位振幅未見明顯變化(圖2B)，測(cè)定ADP90，將季胺堿與灌流臺(tái)式液(對(duì)照)指標(biāo)進(jìn)行比較，計(jì)算縮短率(ADP90臺(tái)-ADP90季/ADP90臺(tái))，30 mg/L和100 mg/L季胺堿縮減率分別為(5.4±2.5)%(n=4)，(7.6±6.2)%(n=4),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 季胺堿和叔胺堿對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位的影響

注：A.叔胺堿(3、10 mg/L);B. 叔胺堿(30、100 mg/L);C. 季胺堿(1、3 mg/L);D. 季胺堿(30、100 mg/L)

2.2 季胺堿和叔胺堿對(duì)HERG電流的影響 轉(zhuǎn)染HERG通道的HEK293細(xì)胞，HERG通道蛋白由GFP熒光蛋白標(biāo)記，在藍(lán)色熒光激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，給予單刺激電壓誘導(dǎo)出HERG電流，可被特非那定(1 μmol/L)所阻斷。見圖2。給予叔胺堿(3～300 mg/L)，HERG通道尾電流隨濃度增加變化逐漸減弱，洗脫后部分恢復(fù)。一例不同濃度的叔胺堿對(duì)同一個(gè)細(xì)胞HERG通道電流的作用。見圖3。將尾電流峰值作為觀察指標(biāo)，將給藥后該指標(biāo)與灌流臺(tái)式液(對(duì)照)指標(biāo)進(jìn)行比較，計(jì)算抑制率(I臺(tái)-I藥/I臺(tái)),其中叔胺堿(3、10、30、100、300mg/L)抑制率分別為：(6.4±5.3)%(n=4)、(15.1±8.7)%(n=4)、(31.6±10.2)%(n=7)、(80.2±10.3)%(n=6)、100%(n=2),采用logistic公式y(tǒng)=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)p]，A1、A2分別為最小和最大抑制率，x0為IC50，p為斜率)進(jìn)行擬合，繪制量效曲線(圖3)，計(jì)算出叔胺堿的IC50為(55±7.2)mg/L。給予叔胺堿(1、3 mg/L)灌流，HERG通道尾電流出現(xiàn)增強(qiáng)，洗脫后恢復(fù)，圖4顯示1例叔胺堿(1、3 mg/L)對(duì)同一個(gè)細(xì)胞HERG通道電流的作用。將尾電流峰值作為觀察指標(biāo)，計(jì)算增強(qiáng)率(I藥-I臺(tái)/I臺(tái)),其中1 mg/L和3 mg/L季胺堿增強(qiáng)率分別為：(28.2±6.9)%(n=4)、(40.6±11.3)%(n=4)。給予叔胺堿(30、100、300 mg/L)灌流，HERG通道尾電流出現(xiàn)抑制，洗脫后恢復(fù)，圖4顯示一例叔胺堿(10、30、100 mg/L)對(duì)同一個(gè)細(xì)胞HERG通道電流的作用。30 、100 、300 mg/L季胺堿抑制率分別為：(39.4±6.7)%(n=4)、(84.7±0.7)%(n=2)、100%(n=2)。10 mg/L季胺堿呈現(xiàn)出對(duì)HERG通道電流的雙向作用，2個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)為增強(qiáng)效應(yīng)，2個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HERG通道的HEK293細(xì)胞和特非那定的抑制作用

圖3 叔胺堿對(duì)HERG通道電流的作用

圖4 季胺堿對(duì)HERG通道電流的作用

3 討論

現(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，延胡索中的主要活性成分為叔胺和季銨型兩類生物堿，其中叔胺堿含量約為0.65%，季銨堿含量約為0.3%[7]。這2類成分在結(jié)構(gòu)、溶解性和藥理作用上也有著很大的不同：以延胡索甲素，乙素，丙素，丁素等為代表的叔胺型生物堿幾乎不溶于水，往往具有良好的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用，是延胡索用于傳統(tǒng)止痛治療的主要活性成分，而延胡索在抗心肌缺血、減少心肌氧耗等方面的顯著作用，主要是緣于而水溶性較好的季銨堿，其主要包括小檗堿型的黃連堿、小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己胺等[8-10]。早在上世紀(jì)八十年代馬勝興、陳可冀等發(fā)現(xiàn)延胡索堿具有治療快速性心律失常的作用，而且叔胺堿和季銨堿對(duì)心電圖產(chǎn)生不同影響：叔胺堿能夠引起心電圖P、QRS波增寬和P-R、Q-T間期延長(zhǎng)，與奎尼丁對(duì)心電圖的影響頗為相似，而季胺堿具有與乙胺碘呋酮相似的延長(zhǎng)Q-T間期、使T波變形、心率減慢和擴(kuò)張血管及降低血壓等作用，在抗烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常治療作用的實(shí)驗(yàn)中，延胡索總堿中水不溶性(相當(dāng)于叔胺堿)部分作用更為顯著，表明叔胺堿和季胺堿在快速性心律失常方面具有不同的作用機(jī)制和作用特點(diǎn),隨后的研究發(fā)現(xiàn)延胡索堿的一些主要單體化合物可以抑制鉀離子通道和鈣離子通道，延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期，降低自律性等作用[5]。本研究從動(dòng)作電位和離子通道角度探討叔胺堿和季胺堿的抗心律失常方面不同的作用機(jī)制和作用特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的叔胺堿和季胺堿均可以延長(zhǎng)豚鼠心室肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程(APD)，這可能是2種生物堿皆可延長(zhǎng)心電圖Q-T間期的原因，但是在低濃度2種生物堿的作用相反，叔胺堿對(duì)APD無明顯影響，而季胺堿可明顯縮短APD，季胺堿的效應(yīng)雙相性可能是其治療快速型心律失常方面弱于叔胺堿的原因。

目前認(rèn)為心肌細(xì)胞動(dòng)作電位形成與維持是心肌細(xì)胞的特異性或非特異性離子通道在動(dòng)作電位各期呈現(xiàn)不同開閉的結(jié)果，心臟快速延遲整流鉀電流(IKr)是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位3期復(fù)極的主要電流，對(duì)IKr通道的抑制是其延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程的機(jī)制之一，但是天然表達(dá)的IKr電流幅值較小，易受其他通道電流的干擾。HERG基因編碼IKr的α亞單位，通過利用轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)HERG通道的人胚腎細(xì)胞株(HEK-293)建立的外源性表達(dá)系統(tǒng)可以有效解決這些問題[11-13]。本研究采用這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞觀察了叔胺堿和季胺堿對(duì)HERG通道的影響，結(jié)果顯示高濃度的叔胺堿和季胺堿均可以抑制HERG通道電流，低濃度的叔胺堿可輕度抑制HERG通道電流，而低濃度的季胺堿與之相反，興奮HERG通道電流，也呈現(xiàn)明顯的雙相性。叔胺堿和季胺堿對(duì)HERG通道的影響與對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的作用相一致，表明這2種生物堿對(duì)動(dòng)作電位的作用主要是通過抑制IKr產(chǎn)生的，也進(jìn)一步說明延胡索堿的抗快速心律失常的靶點(diǎn)之一可能是IKr的α亞單位。一些文獻(xiàn)報(bào)道了延胡索堿的一些單體化合物也對(duì)心肌細(xì)胞的L-型鈣通道具有抑制效應(yīng)[14]，說明延胡索堿的抗快速心律失常也許是多種特異性或者非特異離子通道共同作用的結(jié)果，后續(xù)的研究將進(jìn)一步觀察其他類型離子通道的作用。另一方面，阻斷IKr電流可導(dǎo)致心電圖QT間期延長(zhǎng)、T波和U波異常等，易發(fā)生室性心律失常，尤其是尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速(TdP)，可致猝死，體外IKr/HERG通道檢測(cè)目前已成為心血管安全性藥理試驗(yàn)的重要部分,近年中藥注射劑頻發(fā)不良反應(yīng)事件，中藥注射劑對(duì)QT間期的影響缺乏風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[15]。由于通過口服等方式攝入體內(nèi)的延胡索堿含量較低，所以心臟毒性并不明顯，若制成延胡索堿注射劑時(shí)，叔胺堿的對(duì)HERG電流抑制的IC50已經(jīng)達(dá)到55 mg/L，有必要對(duì)其心臟毒性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了心臟快速延遲整流鉀電流是延胡索堿的抗心律失常機(jī)制主要靶點(diǎn)之一，并且延胡索堿的2種生物堿叔胺堿和季胺堿對(duì)這種離子通道的作用存在差異。

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