楊 寧,王偉明,姚 琳,董 坤

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院 中藥研究所,黑龍江 哈爾濱 150036)

果露酒是果酒和露酒的統(tǒng)稱。果酒是指除葡萄外采用其他水果為原料,經(jīng)浸泡法、發(fā)酵法或浸泡結(jié)合發(fā)酵法釀制而成的低酒精度飲料[1]。露酒是指以蒸餾酒、發(fā)酵酒或食用酒精為酒基,食品添加劑作為呈味、呈香、呈色物質(zhì),按一定生產(chǎn)工藝加工而成的飲料[2],果露酒集文明、保健、營養(yǎng)、時尚于一體[3-4],因此人們對其的需求不斷地提高。果露酒的總糖含量是影響其質(zhì)量和區(qū)分種類的重要指標之一[5]。

目前,總糖的測定方法有滴定法、比色法和連續(xù)流動分析法,短波近紅外光譜技術(shù)等新型的技術(shù)方法[6]。實驗室常規(guī)的檢測方法是滴定法和比色法。直接滴定法對酒液中總糖含量、滴定條件、滴定速度等都有要求,且實驗人員操作熟練程度對結(jié)果影響也很大[7-9],況且果露酒酒體顏色較深,滴定時酒液消耗大,滴定終點受干擾肉眼很難判定。3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)比色法是半微量定糖法,雜質(zhì)干擾較少,且操作簡便快速,適宜批量檢測,可用于果露酒產(chǎn)品研發(fā)過程和成品的總糖測定[10]。

本實驗的原理是在氫氧化鈉或丙三醇的的存在下,還原糖能將3,5-二硝基水楊酸(DNS)中的硝基還原成氨基,生成氨基化合物,此化合物在過量的氫氧化鈉堿性溶液中呈橘紅色。本實驗利用鹽酸將果露酒中總糖水解為還原糖,在一定波長下具有最大吸收,并且吸光度與還原糖含量存在線性關(guān)系從而計算總糖含量[11]。因此本研究考察波長、顯色劑加量、沸水浴加熱時間、顯色時間等總糖水解液的檢測條件,采用正交試驗篩選最佳的果露酒總糖的水解條件,建立DNS法檢測果露酒中總糖含量的方法,以期為此發(fā)酵型果露酒的實際研發(fā)生產(chǎn)和質(zhì)量標準提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵型果露酒:由黑龍江省中醫(yī)藥科學院中藥研究所提供；D-無水葡萄糖對照品(含量≥99.06%,色譜純):成都瑞芬思生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸(化學純):國藥集團化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉(均為分析純):天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水:由DZG-303A艾科浦超純水機制得。

1.2 儀器與設(shè)備

US/VIS Lambda 365紫外可見分光光度儀:美國Perkin Elmer公司；BSA224S-CW萬分之一電子天平:德國Sartorius公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋、DHG9140A電熱鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

DNS試劑的配制[12]:稱取18.2 g酒石酸鉀鈉、0.63 g 3,5-二硝基水楊酸、2.1gNaOH、0.5g苯酚、0.5g無水Na2SO3,分別加少量超純水溶解,將酒石酸鉀鈉溶液放于45℃水浴鍋,然后依次加入上述溶解好的試劑,邊加邊攪拌,取出后冷卻至室溫,加超純水定容至100 mL,貯存于棕色瓶內(nèi),暗處保存,一周后使用。

葡萄糖標準溶液的配制[13-14]:精密稱取100 mgD-無水葡萄糖對照品,用超純水定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配制成1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液備用。

1.3.2 檢測條件的優(yōu)化

檢測波長考察:取3支25 mL具塞比色管編號分別為A、B、C。A:精密吸取1 mg/mL葡萄糖對照品溶液1 mL,分別加入1 mL超純水、1 mL顯色劑(DNS試劑)；B:精密吸取2 mL超純水,加1 mL顯色劑。A、B比色管置于沸水浴中反應5 min,迅速冷卻至室溫,搖勻,定容至刻度,顯色15 min；C:取25 mL果露酒酒液原樣至比色管。A、B、C三組以空白超純水作參比,在波長400～650 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,每隔20 nm采集吸光度值。分析光譜掃描圖,根據(jù)“吸收最大,干擾最少”的原則選擇最佳的波長作為檢測波長。

DNS法顯色條件的考察:于25 mL容量瓶中分別加入1 mL 1 mg/mL葡萄糖溶液、1 mL超純水,考察顯色劑添加量(0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0mL)、沸水浴加熱時間(1min、3min、5min、7min、9min、11 min、13 min、15 min)、顯色時間(5 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min)在波長540 nm處檢測吸光度值。

1.3.3 果露酒中總糖水解條件考察

只有果露酒中的糖類充分水解,總糖含量測定結(jié)果才準確,影響水解的因素主要有水解時間、水解溫度、酸的種類和添加量。本實驗選擇濃鹽酸與超純水按照體積比1∶1稀釋后的鹽酸溶液作為水解酒液糖類的酸,試驗考察的因素為水解時間、水解溫度及1∶1(V/V)鹽酸添加量3個因素。在GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]水解條件(水解溫度:68℃；水解時間:15 min；1∶1(V/V)鹽酸加量:5 mL)的基礎(chǔ)上,設(shè)計一個L9(33)3因素3水平的正交試驗,正交試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 水解條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis conditions

1.3.4 總糖含量計算方法

果露酒中總糖含量(以葡萄糖計)計算公式如下:

式中:C為葡萄糖標準回歸方程計算所得果露酒中葡糖糖的質(zhì)量濃度,mg/mL；V1為測定時吸取原酒液的體積,mL；V2為酒液稀釋定容的體積,mL；0.9為以葡萄糖計算酒液總糖含量的換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1 檢測波長的選擇

根據(jù)1.3.1節(jié)的操作方法將A、B、C組(分別為對照品+顯色劑+水組、顯色劑+水組、原酒液組)分別在波長400～650 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描,每隔20 nm采集吸光度值,結(jié)果如圖1。

圖1 光譜掃描結(jié)果Fig.1 Spectral scanning results

由圖1可知,A組:在波長460～650 nm范圍內(nèi)吸光度值持續(xù)減小,在波長460 nm處吸光度值最大。B組:在波長540～650 nm范圍內(nèi)光譜曲線與基線幾乎重合,在波長400～540 nm范圍內(nèi)吸光度值急劇下降,在波長440 nm處值達最大；A、B兩組在波長400～520 nm范圍內(nèi)曲線波動均較大,吸光度值不穩(wěn)定。C組:在波長400～650 nm范圍內(nèi)吸光度值呈平穩(wěn)下降趨勢。綜合考慮,選擇原酒液色素吸光度值較小,顯色劑吸收較小,對照品吸收較大且平穩(wěn)的波長作為檢測波長。因此最終選擇540 nm為檢測波長。

2.1.2 顯色劑添加量的選擇

為既能使顯色劑與溶液充分反應,又避免顯色試劑浪費,特選擇最佳顯色劑添加量,考察添加顯色劑0.5～4.0mL對葡萄糖溶液在波長540 nm處吸光度值的影響,檢測結(jié)果如表2。

表2 顯色劑添加量對葡萄糖溶液吸光度值的影響Table 2 Effect of color developing agent addition on the absorbance value of glucose solution

由表2可知,顯色劑添加量在0.5～3.0 mL范圍時,吸光度值逐漸增大；在3.0～4.0 mL范圍時,吸光度值基本不變；顯色劑添加量為3.0 mL時,葡萄糖對照品溶液的吸光度值達到最大,因此顯色劑添加量選擇3 mL。

2.1.3 沸水浴加熱時間的選擇

考察沸水浴加熱時間對葡萄糖溶液在波長540 nm處吸光度值的影響,結(jié)果如表3所示。由表3可知,當沸水浴加熱時間為1～9 min時,溶液的吸光度值不斷增大；當沸水浴加熱時間為9～15 min時,吸光度值略有減??；當沸水浴加熱時間為9 min時,吸光度值達最大,因此確定沸水浴加熱時間為9 min。

表3 沸水浴加熱時間對葡萄糖溶液吸光值的影響Table 3 Effect of boiling water bath heating time on the absorption value of glucose solution

2.1.4 顯色時間的選擇

考察顯色時間對葡萄糖溶液在波長540 nm處吸光度值的影響,結(jié)果如表4所示。由表4可知,吸光度值在0～40 min內(nèi)變化不明顯,當顯色時間為20 min時,吸光度值相對較穩(wěn)定,為保證顯色的充分和穩(wěn)定,選擇顯色20 min時測定吸光度值。

表4 顯色時間對葡萄糖溶液吸光度值的影響Table 4 Effect of color developing time on the absorbance value of glucose solution

2.2 標準曲線的繪制與結(jié)果分析

在確定了最佳的檢測條件后,進行葡萄糖標準曲線的繪制。精密吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL1.3.1節(jié)已配制好的1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液,分別加入至25 mL具塞比色管中,各加水至2 mL,另加3 mL顯色劑,于沸水浴中加熱9 min,立即冷卻至室溫,定容至刻度,顯色20 min于波長540 nm處,超純水為空白作參比檢測吸光度值,以葡萄糖質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,葡萄糖標準曲線回歸方程為:y=0.867 5x-0.051 9,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8,表明葡萄糖溶液在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 總糖水解條件優(yōu)化結(jié)果與分析

精密吸取10 mL稀釋50倍的酒液于100 mL容量瓶中,采用正交試驗設(shè)計對總糖水解條件進行優(yōu)化,正交試驗結(jié)果見表5,方差分析見表6。

表5 水解條件正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for hydrolysis conditions optimization

由表5可知,極差分析結(jié)果表明,對吸光度值的影響大小依次為A＞C＞B,即水解溫度＞1∶1(V/V)鹽酸添加量＞水解時間。果露酒總糖的最佳水解條件為A3B3C3,即水解溫度80 ℃、水解時間20 min、1∶1(V/V)鹽酸添加量7 mL。

由表6可知,水解溫度對結(jié)果的影響較為顯著(P＜0.05)；其他因素對結(jié)果均無顯著性影響(P＞0.05)。

表6 正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取同批次稀釋50倍的果露酒液1份,按上述確定的檢測條件和水解條件在波長540 nm處連續(xù)測定6次吸光度值。測定結(jié)果分別為0.776、0.777、0.780、0.778、0.779、0.778,計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)值為0.18%＜2%,說明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗

取5份同批次稀釋50倍的果露酒液,按上述確定的條件同時測吸光度值,檢測結(jié)果為0.764、0.768、0.770、0.766、0.768,RSD值為0.30%＜2%,說明DNS法測定果露酒中總糖含量重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取1份同批次稀釋50倍的果露酒液,分別放置20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時,根據(jù)已確定的檢測條件,檢測吸光度值,檢測結(jié)果為0.772、0.774、0.780、0.782、0.783,RSD值為0.63%＜2%,表明使用DNS法測定果露酒總糖含量在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 加標回收率試驗

精密吸取稀釋50倍的果露酒多糖水解液3份各0.5 mL,分別加入3份不同體積的1.0 mg/mL葡萄糖溶液,進行加標回收率試驗[16],按照上述確定的檢測條件測定吸光度值,計算回收率及RSD值,結(jié)果如表7所示。由表7可知,總糖含量檢測結(jié)果的回收率在98.00%～99.17%,平均回收率為98.53%,RSD值為0.50%＜2%,表明該方法具有良好的準確度。

表7 加標回收率試驗結(jié)果Table 7 Results of adding standard recovery rate tests

2.5 果露酒中總糖含量測定

精密吸取10 mL稀釋50倍的3批不同的果露酒液于100 mL容量瓶,按照上述優(yōu)化的條件對果露酒樣品中總糖水解的葡萄糖質(zhì)量濃度進行檢測,并根據(jù)1.3.4中的公式計算果露酒中總糖的平均含量為45.12 mg/mL。

3 結(jié)論

本研究對果露酒中總糖的水解條件和還原糖的檢測條件進行了優(yōu)化,建立了3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定發(fā)酵型果露酒中總糖含量。最終確定DNS法測定果露酒中還原糖的檢測條件為:檢測波長540 nm,沸水浴加熱9 min,DNS顯色劑3 mL,顯色時間20 min；總糖的水解條件為添加7 mL 1∶1(V/V)鹽酸溶液,80℃水解20 min；葡萄糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8)；試驗精密度、重復性和穩(wěn)定性試驗結(jié)果的相對標準偏差(RSD)均＜2%,平均加標回收率為98.53%,RSD值為0.50%。結(jié)果表明該檢測方法可靠、準確、重現(xiàn)性好。因此,可使用DNS法檢測果露酒中總糖含量并且可為總糖的測定及發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)和借鑒。

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