張賽圣，楊寶林，程麗霞，萬斌，聶菁，胡小令，呂誠

1.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院，江西南昌市330006；2.十堰市人民醫(yī)院，湖北十堰市442000；3.湖北省東風(fēng)公司總醫(yī)院，湖北十堰市442008

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明[1]。近年來，AD的免疫炎癥學(xué)說受到越來越多的關(guān)注[2]。研究表明，AD的神經(jīng)病理學(xué)特征老年斑的主要成分β淀粉樣蛋白(beta amyloid,Aβ)在腦內(nèi)沉積引發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)是AD重要的病理機(jī)制之一。Aβ可激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌、釋放白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子α、補(bǔ)體、一氧化氮等免疫炎性介質(zhì)[3]。免疫炎性介質(zhì)可抑制突觸傳遞可塑性的重要指標(biāo)長時程增強(qiáng)[4]，減少突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，使突觸的結(jié)構(gòu)和功能受損[5]。

雷公藤內(nèi)酯醇具有抗炎、免疫抑制作用。大量研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用[6-7]。我們的前期工作也顯示，雷公藤內(nèi)酯醇可以緩解AD大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的退化[8]。

樹突棘是存在于哺乳動物大腦神經(jīng)元樹突上的小突起，構(gòu)成約90%興奮性突觸的突觸后部分，是信息獲得與儲存的關(guān)鍵和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明，樹突棘的主要細(xì)胞骨架成分是肌動蛋白；肌動蛋白的聚合和/或解聚是樹突棘運(yùn)動、生長和塑形的基礎(chǔ)；樹突棘形態(tài)的改變通過樹突棘內(nèi)肌動蛋白的重排而實現(xiàn)[9]。肌動蛋白的重排主要受肌動蛋白結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)，drebrin和cofilin是調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)的兩個主要肌動蛋白結(jié)合蛋白[10-11]。

本研究觀察雷公藤內(nèi)酯醇對AD大鼠模型海馬神經(jīng)元樹突棘及drebrin和cofilin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，4月齡，體質(zhì)量250～275 g，由南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供，動物合格證號贛(動)96-021。實驗過程中對動物的處置嚴(yán)格遵守動物倫理準(zhǔn)則和使用指南的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實驗試劑

Aβ1-40：美國SIGMA公司。雷公藤內(nèi)酯醇(批號070929，純度99.8%)：福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所。drebrin鼠抗單克隆抗體：英國ABCAM公司。cofilin兔抗多克隆抗體：美國ANBO生物技術(shù)公司。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋公司。Trizol試劑：美國INVITROGEN公司。RevertAidTMHMinus First Strand cDNA Synthesis Kit：立陶宛FERMENTAS公司。2×Easy Taq PCRSuperMix：北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增用引物：南京金斯瑞生物科技公司。硝酸銀：上海試劑一廠。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-40的孵育

取Aβ1-400.1 mg溶解于無菌生理鹽水20μl，37℃恒溫烤箱孵育6 d，終濃度為5μg/μl。

1.2.2 動物分組與藥物干預(yù)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成對照組、模型組和用藥組，每組20只。

模型組和用藥組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，用微量注射器向右側(cè)海馬區(qū)(前囟后3.0 mm，右側(cè)旁開2.0 mm，硬腦膜下2.9 mm)一次性緩慢注射凝聚態(tài)Aβ1-402μl[12-13]。對照組在相同部位注入等容積生理鹽水。

雷公藤內(nèi)酯醇溶解于4%丙二醇溶液中，用藥組每天腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇0.4 mg/kg[8]，共15 d。對照組和模型組腹腔注射等容積4%丙二醇。

治療結(jié)束后，每組取大鼠5只用于Golgi染色，5只用于drebrin免疫組化染色，5只用于cofilin免疫組化染色，5只用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse tran-scription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測。

1.2.3 Golgi染色

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，常規(guī)灌注固定，取腦組織置于灌注液中后固定1周。將含注射點的組織塊修整厚度為2～3 mm。參照Wan等[8]的方法進(jìn)行Golgi染色。每個動物在海馬注射區(qū)附近隨機(jī)選擇9個胞突顯示較完整的錐體細(xì)胞，采用Image-Pro Plus 5.1顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行樹突棘密度的測定。在1000倍油鏡下觀察樹突棘，從胞體發(fā)出的樹突第1次分支開始，計算60μm長度范圍內(nèi)樹突棘數(shù)，計算10μm平均樹突棘數(shù)。

1.2.4 免疫組化染色

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，常規(guī)灌注固定，取腦組織置于灌注液中后固定3 h，置30%蔗糖中，待腦組織完全沉底后在注射點附近行連續(xù)冠狀冰凍切片，厚20μm。按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。一抗工作濃度分別為drebrin 1∶100、cofilin 1∶200。用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對照實驗。每個動物在海馬注射區(qū)附近隨機(jī)取互不重疊的9個視野，在顯微鏡(100×)下采用Image-Pro Plus 5.1顯微圖像分析系統(tǒng)測drebrin陽性產(chǎn)物平均光密度和cofilin陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度。

1.2.5 RT-PCR檢測

動物斷頭處死，快速開顱取腦，取海馬組織100 mg，Trizol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試驗盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

drebrin上游引物5'-CCC CAC GGA GGA CTT GAT-3'，下游引物5'-GGC TGA GGG CAT AGT TAG GA-3'，擴(kuò)增片段長度454 bp；confilin上游引物5'-TGT GGC TGT CTC TGA TGG AG-3'，下游引物5'-TTG TCT GGCAGCATC TTGAC-3'，擴(kuò)增片段長度222 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游引物5'-GGTATG GGT CAGAAG GAC TCC-3'，下游引物5'-TGA TCT TCA TGG TGC TAG GAG CC-3'，擴(kuò)增片段長度857 bp。預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s，退火56℃，30 s，延伸72℃，40 s，32個循環(huán)；總延伸72℃，10 min。

RT-PCR產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖電泳，用Image Tool 2.0軟件分析結(jié)果，目的基因表達(dá)強(qiáng)度以目的基因與β-actin的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Golgi染色

對照組大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘數(shù)量多而密集，模型組大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度明顯低于對照組(P＜0.01)，用藥組大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度高于模型組(P＜0.05)。見表1、圖1。

2.2 免疫組化染色

drebrin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色，呈點狀或顆粒狀分布于海馬神經(jīng)氈區(qū)，海馬細(xì)胞層缺乏染色。模型組drebrin平均光密度較對照組明顯降低(P＜0.01)，用藥組drebrin平均光密度較模型組明顯升高(P＜0.01)。見表2、圖2。

cofilin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色，主要分布于海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)。模型組cofilin陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度較對照組明顯升高(P＜0.01)，用藥組cofilin陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度較模型組減少(P＜0.05)。見表3、圖3。

2.3 RT-PCR檢測

模型組drebrin mRNA表達(dá)明顯低于對照組(P＜0.01)，用藥組drebrin mRNA表達(dá)高于模型組(P＜0.05)。見表4、圖4。

模型組cofilin mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.01)，用藥組cofilin mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P＜0.01)。見表4和圖5。

表1 各組海馬神經(jīng)元樹突棘密度

表2 各組海馬神經(jīng)元drebrin陽性產(chǎn)物平均光密度

表3 各組海馬神經(jīng)元cofilin陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度

表4 各組海馬神經(jīng)元drebrin和cofilin mRNA表達(dá)水平

圖1 各組海馬神經(jīng)元樹突棘密度(Golgi染色，bar=10μm)

圖2 各組海馬神經(jīng)元drebrin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物(免疫組化染色，bar=50μm)

圖3 各組海馬神經(jīng)元cofilin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物(免疫組化染色，bar=50μm)

圖4 各組海馬神經(jīng)元drebrin RT-PCR檢測結(jié)果

圖5 各組海馬神經(jīng)元cofilin RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

許多證據(jù)表明，Aβ對樹突棘有毒性作用。Aβ1-42可使培養(yǎng)的小鼠海馬腦片樹突棘大量丟失[14]。Tg2576和APP/Lo轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度明顯下降[15]。用高分辨共聚焦顯微鏡觀察AD模型動物和AD患者尸檢腦組織中樹突和老年斑的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，穿過或距離Aβ纖維聚積部位40μm以內(nèi)的樹突分支出現(xiàn)多種樹突異常改變：顯著的樹突棘丟失，樹突干萎縮、彎曲、靜脈曲張樣變，出芽等[16]。本研究顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度下降。提示Aβ對樹突棘有損害作用。

研究表明，Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、一氧化氮、超氧化物等炎性介質(zhì)，使Tau蛋白磷酸化，引起細(xì)胞骨架重組，阻礙正常微管聚集和軸突穩(wěn)定，導(dǎo)致突觸蛋白和突觸丟失[17]；Aβ也可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，抑制長時程增強(qiáng)，導(dǎo)致突觸功能退化[18]；炎癥介質(zhì)還可抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)的cofilin磷酸化，阻礙樹突棘內(nèi)肌動蛋白聚合[19]。Aβ對樹突棘的神經(jīng)毒性作用可能與AD腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

drebrin和cofilin是調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)的兩個主要肌動蛋白結(jié)合蛋白。研究表明，drebrin能促進(jìn)樹突棘的生長發(fā)育，其作用機(jī)制有：①抑制肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用，減少纖維型肌動蛋白的收縮力和樹突棘的回縮；②募集profilin(肌動蛋白聚合的啟動子)進(jìn)入纖絲，引起棘延長；③抑制原肌球蛋白和α-輔肌動蛋白，并競爭性與纖維型肌動蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架網(wǎng)的動力學(xué)，進(jìn)而引起樹突棘形態(tài)改變。

cofilin能切割纖維型肌動蛋白并加速亞基從纖維型肌動蛋白末端分離，導(dǎo)致纖維型肌動蛋白的快速解聚[10-11]。來自細(xì)胞模型、動物模型和患者尸檢實驗資料表明，AD樹突棘內(nèi)肌動蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制受損。柴繼俠等[20]發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠神經(jīng)元內(nèi)Aβ積聚，樹突棘蛋白drebrin表達(dá)下降。Julien等[21]發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)drebrin mRNA表達(dá)下降與AD病程進(jìn)展密切相關(guān)。Yao等[22]發(fā)現(xiàn)，Tg19959轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)和原代培養(yǎng)神經(jīng)元內(nèi)cofilin表達(dá)明顯升高。Kojima等[23]認(rèn)為，AD腦內(nèi)發(fā)生Aβ積聚－drebrin/cofilin病理變化－樹突棘形態(tài)變化－突觸功能障礙－認(rèn)知能力下降。

本研究顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元drebrin表達(dá)減少，cofilin表達(dá)增多。與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致，提示樹突棘內(nèi)肌動蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制受損可能是AD樹突和突觸功能異常的重要原因，在AD發(fā)病中扮演重要角色。

雷公藤內(nèi)酯醇是從雷公藤中提取的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類化合物，具有較強(qiáng)的抗炎、免疫抑制作用，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎臟疾病等自身免疫性疾病方面取得較好療效。由于AD的炎癥發(fā)病機(jī)制，雷公藤內(nèi)酯醇可能通過抗炎、免疫抑制機(jī)制對AD進(jìn)行干預(yù)。

Cui等[6]發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇能促進(jìn)APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，緩解APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ沉積和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇能改善5XFAD轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少Aβ在腦內(nèi)的產(chǎn)生和積聚。我們近期的工作表明，雷公藤內(nèi)酯醇可以減輕AD模型大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的損傷性變化[8]。

本研究顯示，雷公藤內(nèi)酯醇可能通過調(diào)節(jié)drebrin和cofilin的表達(dá)，延緩AD模型大鼠海馬神經(jīng)元樹突棘的退化，從而對樹突棘起保護(hù)作用。

由于樹突棘的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，涉及的因子較多，雷公藤內(nèi)酯醇對樹突棘保護(hù)作用的詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。值得注意的是，雷公藤內(nèi)酯醇對生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)有一定毒副作用，臨床應(yīng)用有一定局限性[24]。在發(fā)揮雷公藤內(nèi)酯醇神經(jīng)保護(hù)作用的同時，如何降低其毒副作用值得進(jìn)一步思考。已有文獻(xiàn)報道，從雷公藤中分離到一種雷公藤內(nèi)酯醇的衍生物——雷公藤氯內(nèi)酯醇。藥理活性表明，雷公藤氯內(nèi)酯醇具有比雷公藤內(nèi)酯醇更強(qiáng)的抗炎、免疫抑制作用，但其毒性大大低于雷公藤內(nèi)酯醇[25-26]。雷公藤氯內(nèi)酯醇對樹突棘是否有保護(hù)作用，有待于進(jìn)一步研究。

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