徐明芳，鄭春麗，王洋洋，白衛(wèi)濱*，葉 蕾，崔 靜

（1.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632）

魚類肌肉蛋白質是多種蛋白的復合體，質量分數(shù)高達18%～22%以上，根據(jù)溶解性的不同，魚肉中的蛋白質可以分為3 大類：高鹽溶解蛋白如肌原纖維蛋白（55%～60%）、低鹽溶解的肌漿蛋白（25%～35%）和不溶性基質蛋白（10%～15%）。其中，肌原纖維蛋白約占魚類總蛋白含量的55%～60%，是魚肌肉中含量最高的蛋白質，主要包括肌球蛋白（50%～55%）、肌動蛋白（20%～25%）、原肌球蛋白（5%～10%）和肌鈣蛋白（5%～10%）4 個主要蛋白組分[1-2]。肌動蛋白存在于所有真核細胞中，肌動蛋白在真核細胞進化過程中相當保守[3-4]，低等真核生物（例如酵母）只含有一種肌動蛋白，而多細胞生物通常含有多種肌動蛋白亞型，在哺乳動物和鳥類細胞中至少有6 種肌動蛋白異構體由不同的基因編碼，已分離到6 種肌動蛋白[5]，4 種稱為α-肌動蛋白，分別為橫紋?。ê趋兰。?、心肌、血管平滑肌和腸道平滑肌所特有，另2 種為β-肌動蛋白和γ-肌動蛋白，見于所有肌肉細胞和非肌肉細胞質中[6]。

如圖1[7]所示，肌動蛋白是一種高度豐富的細胞內蛋白，存在于每個真核細胞中，以單體G-肌動蛋白和多聚體F-肌動蛋白2 種形式存在，是細胞骨架的關鍵組成部分[8]。肌動蛋白的多聚體構成右螺旋的四級結構即纖維狀[9-10]，主要功能是聚合成細絲的能力，細絲在細胞黏附、機械收縮、定向遷移、肌肉收縮、細胞分裂和細胞內運輸?shù)然具^程中發(fā)揮重要作用[7]。在非肌細胞中，肌動蛋白G-肌動蛋白和F-肌動蛋白形式之間的動態(tài)轉換調節(jié)多種細胞過程，包括細胞分裂[11]、黏附、運動和物質運輸，除細胞骨架功能外，肌動蛋白可通過核輸入直接結合在許多基因的啟動子區(qū)域，調節(jié)基因轉錄[12]；肌動蛋白也與某些疾病的發(fā)生密切相關，例如阿爾茨海默病[13-14]及心肌病[15-16]，此外肌動蛋白還與衰老相關[17]，對維持心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的正常功能具有重要作用[18-20]。肌動蛋白的研究最早可追溯到19世紀，自肌動蛋白被發(fā)現(xiàn)以來，對肌動蛋白的研究主要以兔[21]、牛[22]、小鼠[23]等哺乳動物為主，在進化過程中，肌動蛋白在蛋白質水平上高度保守，各種生物間氨基酸序列的同源性高達70%以上，但魚類肌動蛋白的研究文獻鮮有報道，魚類肌動蛋白是否具有更高同源性及氨基酸序列的差異性值得深入研究。

圖1 G-肌動蛋白（a）和F-肌動蛋白（b）的結構[7]Fig.1 Structures of G-actin (a) and F-actin (b)

肽質量指紋譜分析，簡稱肽質指紋圖譜，是目前蛋白質組學中鑒定蛋白真實性的高通量分析方法。在蛋白質肽質指紋圖譜研究中，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是常用的分析工具。質量分析器是質譜儀分析鑒定的關鍵核心部件，目前最常用的質量分析器有四極桿、TOF、離子阱、靜電場軌道阱（Orbitrap）等，不同類型的質量分析器組合會構成不同功能的質譜儀，近年發(fā)展二維線性離子阱組合型傅里葉轉換質譜（linear trap quadropole orbitrap mass spectrometry，LTQ Orbitrap MS），因其高分辨能力，在特征肽段、未知蛋白的鑒定和差異蛋白質組的研究中具有獨特優(yōu)勢。Orbitrap質譜儀器最高分辨率可達100 000，檢測到亞10-6級，而TOF質譜儀分辨率小于3 000[24]。徐明芳等[25-26]利用LTQ Orbitrap MS質譜技術分析鑒定不同奶牛品種乳源如南方水牛奶、荷斯坦牛奶和山羊奶乳清蛋白的特征肽段與精細結構，研究了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分肽質指紋圖譜及氨基酸序列差異性，為乳源蛋白真實性檢驗技術的發(fā)展提供依據(jù)。Feng Jixing等[27]利用MALDI-TOF-MS分析南美白對蝦45 kDa蛋白的酶解肽段，鑒定為45 kDa蛋白屬于β-肌動蛋白，氨基酸序列覆蓋率為28%。近年質譜儀在儀器靈敏度，質量分辨率和掃描速度方面又有新的突破，Orbitrap Fusion Lumos三合一高分辨質譜儀是目前最新型質譜儀，如圖2所示。

圖2 Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀Fig.2 Structure of Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer

三合一質譜儀整合了四極桿質量過濾器、超高靜電場軌道阱質量分析器與線性離子阱質量分析器三位一體同時運行，極大提高了離子采集精度與速度，與上一代LTQ Orbitrap MS相比對低至2 ng的蛋白質組樣品的肽段鑒定率增加了3 倍[28]，非常適合蛋白質組學中復雜體系的高通量蛋白檢測。Sathe等[29]采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀對腦脊液樣品鑒定了111 個磷酸酪氨酸肽段及對應66 個蛋白，三合一質譜儀因其高靈敏度、高質量精確度、超高分辨率和掃描速度的優(yōu)勢倍受關注，但該技術用于魚類肌動蛋白的研究鮮見報道。

本研究將采用Orbitrap FusionTMMS四極桿質量過濾器-靜電場軌道阱-線性離子阱三合一高分辨質譜技術對鱖魚、金鯧魚和鱘魚名貴魚類肌動蛋白進行鑒定，通過對其特征肽段與氨基酸序列差異性進行分析，建立肌動蛋白肽質量指紋圖譜，以期為魚類蛋白真實性及品質屬性鑒定提供技術方法，為開拓肌動蛋白在疾病與健康領域的應用研究及魚類蛋白功能食品研發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱖魚（866±111）g、金鯧魚（700±28）g和鱘魚（1 486±98）g購自暨南大學菜市場。

碳酸氫銨、乙腈、三氟乙酸、二硫蘇糖醇、吲哚-3-乙酸、胰蛋白酶均為分析純。

1.2 儀器與設備

Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜儀、Pico17型微型合成離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 待測樣品凍干粉的制備

肌原纖維蛋白的制備參照Lv Mingchun等[30]的方法，有所修改。取魚肌肉組織50 g破碎，加入5 倍體積緩沖液A，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復3～4 次，洗去水溶性蛋白質。取沉淀，沉淀加入10 倍體積緩沖液B，攪拌混勻，于4 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，得到的上清液即肌原纖維蛋白溶液。

雙水相法制備魚肌動蛋白凍干粉參照王洋洋等[31]的方法，在異丙醇質量分數(shù)26%、硫酸銨質量分數(shù)11%，pH 9.0條件下，制備5 L雙水相體系萃取分離體系，肌原纖維蛋白加入量為體系總質量的30%，室溫靜置3 h后分離出上相經過35 ℃真空旋轉蒸發(fā)20 min，4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，蒸餾水透析去鹽，真空冷凍干燥得到肌動蛋白凍干粉存4 ℃保存。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

各稱取1.0 mg凍干粉于1.5 mL離心管中，加入1 mL樣品緩沖液，充分溶解后，沸水浴加熱5 min，冷卻后加樣。參照Laemmli[32]的電泳方法，分離膠10%，濃縮膠5%，電極緩沖液含0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷，0.384 mol/L甘氨酸，0.1%十二烷基硫酸鈉。上樣量為15 μL；開始電泳時濃縮膠電壓為80 V，待樣品進入分離膠后電壓改為120 V。電泳結束后，取出膠片用考馬斯亮藍染色，用無水乙醇/冰醋酸脫色至背景清晰。

1.3.3 蛋白膠內酶解

將獲得的鱖魚、金鯧魚和鱘魚十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠酶解，酶解方法與實施步驟見參考文獻[33]。

1.3.4 試劑配制方法

10 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液：79.06 mg碳酸氫銨溶于超純水中，定容到10 mL。1 mL脫色液：0.5 mL 100%乙腈，0.25 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，0.25 mL ddH2O。4 mL還原劑：6.2 mg二硫蘇糖醇，1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，3 mL dd H2O。4 mL烷基化試劑：40.69 mg吲哚-3-乙酸，1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，3 mL ddH2O。2 mL覆蓋液：0.5 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液，0.2 mL 100%乙腈，1.3 mL ddH2O。酶液儲液：1 mg/mL胰蛋白酶用覆蓋液稀釋至0.02 μg/μL。3 mL萃取液：0.075 mL三氟乙酸，2.01 mL 100%乙腈，0.915 mL dd H2O。1 mL樣品溶解液：0.001 mL甲酸，0.02 mL 100%乙腈，0.979 mL dd H2O。

1.3.5 質譜檢測

凍干的樣品脫鹽后，加入12 μL樣品溶解液，充分振蕩渦旋，離心，取10 μL上清液用Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜分析。樣品經C18反相柱（100 mm×75 μm，3 μm）分離，肽段在反相柱上洗脫梯度為5%～100%乙腈（含0.1%甲酸）洗脫30 min，流速為600 nL/min。

質譜條件：一級質譜的Orbitrap分辨率為60 000，質量掃描范圍m/z350～1 500，最大注入時間為50 ms；二級質譜檢測器類型Orbitrap，分辨率15 000，使用HCD模式碰撞裂解，碰撞能量31%，最大注入時間為100 ms。

1.3.6 質譜數(shù)據(jù)庫檢索與分析方法

根據(jù)樣品物種來源從UniProt下載對應物種的蛋白質組數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)分析使用Xcalibur、MaxQuant等軟件?；谲浖凶詭惴ㄅc圖片可視化功能，根據(jù)設定參數(shù)將液質聯(lián)用技術得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進行匹配，通過肽段的一級和二級碎片的質量在數(shù)據(jù)庫中找到匹配的蛋白質，實現(xiàn)樣品中的蛋白質鑒定。

質譜得到原始數(shù)據(jù)為Raw格式，下載MSFileReader_x86_x64-_3.exe讀數(shù)軟件，打開Xcalibur軟件與MaxQuant 1.6.0.16軟件起始界面，用搜庫軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索，分別在鱖魚、金鯧魚和鱘魚的蛋白質數(shù)據(jù)庫（2019年11月15日下載自NCBI Protein數(shù)據(jù)庫，以Siniperca chuatsi、Trachinotus ovatus和Acipenser sinensis為名，搜索結果分別包含5 186、5 893 條和235 條序列中搜索MS/MS質譜。

以鱖魚為例，鱖魚質譜原始數(shù)據(jù)（Raw文件）通過讀數(shù)軟件MSFileReader_x86_x64-_3.exe后導入MaxQuant 1.6.0.16軟件或Xcalibur軟件中，組特定參數(shù)（groupspecific parameters）Digestion設置為Trypsin，全局參數(shù)（global parameters）設置S.chuatsisequence.fasta數(shù)據(jù)庫，執(zhí)行搜庫功能，通過樣品質譜中每個m/z信號與數(shù)據(jù)庫肽質量列表進行匹配并對整個肽段列表進行排序，在質量容差范圍內的所有匹配項將用于計算分數(shù)和鑒定相應的蛋白質。

搜索參數(shù)設置：數(shù)據(jù)庫為NCBInr，酶為胰蛋白酶，允許最大漏切位點為1，固定修飾為Carbamidomethyl(C)，可變修飾為Oxidation(M)，MS tolerance（容差）為0.15 Da，MS/MS tolerance為0.25 Da，其他參數(shù)均為軟件默認值。在Xcalibur4.0軟件平臺或MaxQuant軟件的可視化窗口下（Viewer）處理一級質譜和二級質譜圖。搜庫結果以combined-txt文件夾形式保存，combined-txt文件夾包含所有鑒定和定量的全部結果。

2 結果與分析

2.1 肌動蛋白的一級質譜與二級質譜

鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白經胰蛋白酶酶解的多肽混合物分別經Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜檢測，采用Xcalibur軟件與MaxQuant軟件在可視化窗口下運行，獲得蛋白質樣品的一級和二級質譜圖，如圖3所示。軟件分析得到鱖魚二級質譜肽段數(shù)量249 個，金鯧魚二級質譜肽段數(shù)量164 個，鱘魚二級質譜肽段數(shù)量141 個，共計554 個肽段，基于篇幅，無法一一展示所有肽段，每種魚類僅選取2 個特征肽段二級質譜如圖4所示，由二級質譜離子峰匹配出相應氨基酸序列。

圖3 3 種魚肌動蛋白一級質譜圖Fig.3 Primary mass spectra of actin from three fish species

圖4 3 種魚肌動蛋白特征肽段二級質譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of signature actin peptides from three fish species

2.2 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白質譜差異性

鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白的多肽混合物分別經Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜分析。質譜得到肽段信息用MaxQuant 1.6.0.16搜庫軟件分別在鱖魚、鱘魚和金鯧魚的蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行檢索，根據(jù)得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)和覆蓋率等綜合評判鑒定出肽段氨基酸序列、肽段來源及所屬蛋白的氨基酸全序列。蛋白鑒定結果見表1。

表1 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白質譜差異性Table 1 Differences in actin mass spectra among S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

MS/MS產生的碎片信息搜庫后會鑒定出氨基酸序列和所屬的蛋白種類，并且肽段對于所屬蛋白來說是否為特征肽段，質譜鑒定結果會直接告知。僅根據(jù)每種魚類的特征肽段不足以鑒定蛋白，而是通過二級質譜產生的所有肽段搜索數(shù)據(jù)庫，根據(jù)質譜鑒定到蛋白的肽段覆蓋率、得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)等參數(shù)綜合評判來鑒定蛋白的類型，這些參數(shù)的值越大，蛋白質鑒定的準確性越高。

如表1所示，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白肽段覆蓋率為59.2%、金鯧魚肽段覆蓋率為54.1%、鱘魚β-肌動蛋白為42.7%，鱖魚有10 個特征肽段，金鯧魚有24 個特征肽段，鱘魚有12 個特征肽段。鑒定結果顯示，鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白的蛋白分子質量和主鏈氨基酸數(shù)量均有差異。鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377，分子質量為41 944 Da，金鯧魚β-肌動蛋白全序列氨基酸數(shù)量為375，分子質量為41 766 Da，蛋白分子質量和全序列氨基酸數(shù)量均大于鱘魚β-肌動蛋白（部分序列氨基酸數(shù)量為248，分子質量為27 921 Da）。鱘魚蛋白質數(shù)據(jù)庫中沒有完整的肌動蛋白氨基酸全序列，只有2 個部分序列，因此鱘魚肌動蛋白酶解后質譜鑒定匹配到的肽段數(shù)、蛋白分子質量和主鏈氨基酸數(shù)量均小于鱖魚和金鯧魚肌動蛋白。

2.3 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白肽指紋圖譜的建立

鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白經胰蛋白酶酶解得到的片段經Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜分析，可鑒定出全部的肽段。得到的肽段經數(shù)據(jù)庫檢索分析可鑒定出肽段的來源，如TTGIVLDAGDGVTHNVPVYEGYALPHAIMR、EDEIAALVVDNGSGMCK、LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK分別屬于鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白、金鯧魚β-肌動蛋白和鱘魚β-肌動蛋白的酶解肽段。鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白、金鯧魚β-肌動蛋白和鱘魚β-肌動蛋白經質譜鑒定得到的全部肽段序列信息分別見表2～4，差異肽段見表5，同時，通過搜索蛋白質數(shù)據(jù)庫獲得肌動蛋白的氨基酸全序列（表6），結果中沒有搜索到鱘魚β-肌動蛋白的完整氨基酸序列，僅有2 個部分序列。

表2 鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白肽段氨基酸序列信息Table 2 Information about peptide sequence of α-actin in S.chuatsi skeletal muscle

表3 金鯧魚β-肌動蛋白肽段氨基酸序列信息Table 3 Information about peptide sequence of T.ovatus β-actin

續(xù)表3

表4 鱘魚β-肌動蛋白肽段氨基酸序列信息Table 4 Information about peptide sequence of A.sinensis β-actin

表6 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白氨基酸序列對比Table 6 Comparison of amino acid sequences of S.chuatsi, T.ovatus and A.sinensis actin

由表2～4可知，不同來源的肌動蛋白經胰蛋白酶酶解后質譜檢測得到的肽段數(shù)量有差異。肽段數(shù)量最多的為鱖魚肌動蛋白，酶解后可檢測到29 個肽段，金鯧魚共檢測到24 個肽段，全為特征肽段，而鱘魚最多檢出13 個肽段。3 種魚類肌動蛋白酶解得到的所有肽段中有多個相同的肽段。

由表5可知，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白、金鯧魚β-肌動蛋白和鱘魚β-肌動蛋白的指紋譜中均有不同數(shù)量的差異肽段。與另外2 種魚類肌動蛋白的指紋譜相比，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白有10 個差異肽段，金鯧魚β-肌動蛋白有5 個差異肽段，鱘魚β-肌動蛋白酶解后鑒定到的肽段數(shù)量最少，僅有3 個差異肽段，因鱘魚蛋白數(shù)據(jù)庫不完善，搜庫中無法匹配到鱘魚肌動蛋白氨基酸全序列，這3 個肽段在蛋白氨基酸全序列位置無法確認，隨著鱘魚蛋白基因轉錄組學深入研究，有望得到進一步相關論證。

表5 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動蛋白肽指紋譜的差異性Table 5 Difference in fingerprints of actin peptides in S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

由表6可知，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白和金鯧魚β-肌動蛋白由于蛋白類型不同，它們的一級結構在氨基酸數(shù)量和排列方面存在明顯差異：鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白序列有377 個氨基酸，金鯧魚β-肌動蛋白序列有375 個氨基酸；2 個氨基酸序列從相似序列開始發(fā)生了21 處氨基酸變異（鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白從第12個氨基酸開始，金鯧魚β-肌動蛋白從第10個氨基酸開始，2 個序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用括號標出）。鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白和部分鱘魚β-肌動蛋白氨基酸序列從相似序列開始發(fā)生了17 處氨基酸的變異（從鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白第74位氨基酸開始，2 個序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用下劃線標出）；部分鱘魚β-肌動蛋白的氨基酸序列與金鯧魚β-肌動蛋白的序列同源性較高，僅有3 個氨基酸存在變異，分別在第160、228、279位氨基酸處。

3 結 論

采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質譜技術分析3 種魚類肌動蛋白肽質指紋譜，肽段序列和蛋白氨基酸全序列比對結果表明，鱖魚肌動蛋白全序列氨基酸數(shù)量和蛋白分子質量均高于金鯧魚和鱘魚。鱖魚肌動蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377，分子質量為41 944 Da；金鯧魚全序列氨基酸數(shù)量為375，分子質量為41 766 Da；鱘魚部分序列氨基酸數(shù)量為248，分子質量為27 921 Da。鱖魚肌動蛋白的酶解肽段質譜檢測到29 個肽段，鑒定為骨骼肌α-肌動蛋白；金鯧魚檢測到24 個肽段，鱘魚則檢出13 個肽段，均鑒定為β-肌動蛋白；與另外2 種魚類肌動蛋白的肽質指紋譜相比，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白有10 個差異肽段，金鯧魚β-肌動蛋白有5 個差異肽段，鱘魚β-肌動蛋白有3 個差異肽段，從氨基酸全序列的排列方式來看，鱖魚骨骼肌α-肌動蛋白與金鯧魚β-肌動蛋白從相似序列開始共有21 處氨基酸變異，與鱘魚β-肌動蛋白從相似序列開始共有17 處氨基酸變異，鱘魚部分β-肌動蛋白氨基酸序列與金鯧魚β-肌動蛋白的序列同源性較高，僅在金鯧魚β-肌動蛋白第160、228、279位氨基酸處存在變異。開展魚肌動蛋白肽質指紋譜研究將為名貴魚類質量品質屬性的鑒定、魚類肌動蛋白標準品的研制及魚蛋白高通量芯片檢測技術的發(fā)展提供新思路與參考依據(jù)，具有重要現(xiàn)實意義與廣泛的應用前景。