王屹，杜婷婷，劉舒佳，劉佳，盧勇泉，楊慧

1.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院，a.檢驗(yàn)科；b.脊柱脊髓外科，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京市神經(jīng)外科研究所，北京市100050；4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京腦重大疾病研究院帕金森病研究所，教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100069

帕金森病是一種與環(huán)境、基因、年齡等多種因素相關(guān)的疾病，主要特征是神經(jīng)退行性變引起的運(yùn)動(dòng)功能障礙[1-2]。帕金森病的主要病理變化是黑質(zhì)紋狀體通路的破壞及殘存多巴胺神經(jīng)元中形成路易體，主要成分為α-突觸核小體(α-synuclein,α-syn)。在帕金森病病理進(jìn)程中，環(huán)境因素和基因因素存在交互作用，環(huán)境因素可能加劇帕金森病相關(guān)基因的易感性，造成神經(jīng)元死亡[3]。

魚藤酮是一種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用的殺蟲劑，與帕金森病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被廣泛用于帕金森病模型的制備。有文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]，魚藤酮能提高α-syn絲氨酸129位磷酸化水平，從而導(dǎo)致α-syn聚集。盡管魚藤酮制備的帕金森病模型是一種能很好重現(xiàn)帕金森病理的模型，并得到一致認(rèn)可[7-10]，但魚藤酮引起α-syn病理變化，包括磷酸化水平升高、α-syn聚集的機(jī)制尚不明確。

α-syn的磷酸化后修飾與α-syn聚集密切相關(guān)。α-syn的磷酸化水平受α-syn激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶去磷酸化活性平衡的調(diào)節(jié)。α-syn特異性激酶可催化α-syn磷酸化，尤其是129位絲氨酸，并導(dǎo)致路易包涵體中磷酸化的α-syn聚集[11-12]。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一α-syn去磷酸化酶。PP2A絲蘇氨酸磷酸酶對(duì)保持α-syn絲氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡極其重要[13]。PP2A催化亞基的磷酸化后修飾，能抑制酶的大部分活力[14]。在細(xì)胞內(nèi)，酪氨酸羥化酶使PP2A的催化亞基307位點(diǎn)酪氨酸磷酸化(phosphorylation of tyrosine 307 at the catalytic subunit of PP2A,pY307-PP2Ac)，這一位點(diǎn)是唯一的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。在黑色素瘤細(xì)胞中，脂質(zhì)閥結(jié)合操作性Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，從而激活鈣調(diào)素，使鈣調(diào)素與Src激酶結(jié)合，激活Src激酶，從而使PP2A催化亞基307位點(diǎn)酪氨酸發(fā)生磷酸化，造成PP2A失活[15]。

研究魚藤酮能否改變PP2A活性，參與帕金森病的病理過程，將為發(fā)現(xiàn)帕金森病的藥物作用靶點(diǎn)提供依據(jù)。本研究通過魚藤酮處理MN9D細(xì)胞，研究PP2A活性變化的情況，并研究PP2A活性變化對(duì)細(xì)胞活力變化的影響。

1 材料與方法

1.1 MN9D細(xì)胞系

原代小鼠胚胎腹側(cè)中腦細(xì)胞與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系N18TG2融合形成的雜交瘤細(xì)胞，由Novartis公司Bastian Hengerer博士惠贈(zèng)，使用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 魚藤酮的制備與細(xì)胞分組

稱取一定量魚藤酮，溶于無菌二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，配制終濃度為5 mmol/L儲(chǔ)存液，-20℃冰箱避光保存，1周內(nèi)使用。使用時(shí)室溫融化，吸取相應(yīng)的量，在培養(yǎng)基中按照比例稀釋成10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。本研究中，除細(xì)胞活力檢測(cè)外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均在直徑90 mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行，加培養(yǎng)基10 ml，加魚藤酮100μl。

實(shí)驗(yàn)分組：正常組正常培養(yǎng)細(xì)胞；對(duì)照組培養(yǎng)液中加入與魚藤酮組等體積的DMSO；魚藤酮組培養(yǎng)液中加入不同濃度魚藤酮培養(yǎng)24 h；魚藤酮+C2組培養(yǎng)液中先加5μmol/L PP2A特異性激動(dòng)劑C2-神經(jīng)酰胺培養(yǎng)0.5 h，再加魚藤酮50 nmol/L培養(yǎng)8 h后，撤去C2-神經(jīng)酰胺，再培養(yǎng)至24 h。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

MN9D細(xì)胞用培養(yǎng)基100 μl按1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板。細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，在培養(yǎng)體系中加入適當(dāng)體積魚藤酮，使其終濃度分別為10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。24 h后，各孔加入5 mg/ml噻唑藍(lán)20μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100μl，避光振蕩10 min，使生成的顆粒完全溶解。將孔板置于酶標(biāo)儀中，讀取550 nm波長(zhǎng)處吸光度值，統(tǒng)計(jì)制圖，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 Western blotting

在RAPI細(xì)胞裂解液中，按100∶1加入復(fù)合磷酸酶抑制劑和復(fù)合蛋白酶抑制劑；收集細(xì)胞，裂解離心，取上清液，BCA法蛋白定量。積層膠80 V、分離膠120 V電泳后，PVDF膜100 mA半干轉(zhuǎn)1 h；將PVDF膜置于10%牛奶封閉液中，室溫封閉1 h，依次孵育兔抗pY307-PP2Ac、鼠抗PP2Ac一抗(ABCAM公司，均1∶2000)和兔抗β-actin一抗(SIGMA公司，1∶2000)，以及羊抗鼠680熒光二抗和羊抗兔800熒光二抗(LI-COR公司，均1∶5000)。應(yīng)用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-CORBIOSCIENCES公司)成像，信號(hào)強(qiáng)度用Image J軟件(美國(guó)National Institutes of Health)分析，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。

1.5 PP2A活性檢測(cè)

采用PP2A檢測(cè)試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，用試劑盒中的細(xì)胞處理液收集細(xì)胞，提取蛋白，建立Bradford法測(cè)定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白濃度測(cè)定。應(yīng)用分光光度計(jì)分別測(cè)定樣品背景磷濃度、樣品總活性磷濃度、非特異活性磷濃度。計(jì)算樣品特異性活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果以(xˉ±s)表示，進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 魚藤酮對(duì)細(xì)胞及PP2A活性的影響

2.1.1 細(xì)胞活力

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h，細(xì)胞活力分別為正常組的62.16%(F=27.000,P＜0.001)、 53.69%(F=27.000,P＜0.001)、 47.83%(F=27.000,P＜0.001)、 47.50%(F=27.000,P＜0.001)(圖1)。

2.1.2 Western blotting

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L魚藤酮培養(yǎng)24 h，pY307-PP2Ac水平分別為正常組的99.62%、136.69%、190.20%、158.92%?？侾P2Ac水平無明顯改變(圖2～圖4)。

50 nmol/L魚藤酮組pY307-PP2Ac水平最高，故后續(xù)試驗(yàn)魚藤酮濃度均為50 nmol/L。

圖1 各組MN9D細(xì)胞活力比較

圖2 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖3 各組p Y307-PP2Ac水平比較

圖4 各組總PP2Ac水平比較

2.1.3 PP2A活性

魚藤酮組PP2A活性低于對(duì)照組(F=6.000,P=0.027)，見圖5。

圖5 各組PP2A活性比較

2.2 C2-神經(jīng)酰胺對(duì)魚藤酮作用的影響

2.2.1 Western blotting

魚藤酮+C2組pY307-PP2Ac水平為正常組的99.95%，與魚藤酮組有非常顯著性差異(F=8.000,P=0.004)；各組間總PP2Ac水平無顯著性差異(圖6～圖8)。

圖6 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖7 各組p Y307-PP2Ac水平比較

圖8 各組總PP2Ac水平比較

2.2.2 PP2A活性

魚藤酮+C2組PP2A活性高于魚藤酮組(F=4.600,P=0.024)。見圖9。

圖9 各組PP2A活性比較

2.2.3 細(xì)胞活力

魚藤酮+C2組細(xì)胞活力為正常組的74.47%，顯著高于魚藤酮組60.83%(F=28.000,P＜0.001)。圖10。

3 討論

本研究顯示，魚藤酮可通過提高pY307-PP2Ac水平，抑制MN9D細(xì)胞PP2A活性，并且這一作用有一定的濃度依賴性。

C2-神經(jīng)酰胺是PP2A特異性激動(dòng)劑，通過與PP2A催化亞基C相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)PP2A的激動(dòng)[16]。5～20μmol/L神經(jīng)酰胺可以激活PP2A三聚體[17]。C2-神經(jīng)酰胺對(duì)PP2A的作用是特異的，其他神經(jīng)酰胺不能激動(dòng)PP2A[17]。本研究顯示，C2-神經(jīng)酰胺可以改善魚藤酮造成的細(xì)胞PP2A活性下降，這一過程伴隨著pY307-PP2Ac水平下調(diào)。提示魚藤酮對(duì)pY307-PP2Ac進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與了魚藤酮誘導(dǎo)的PP2A活性下降。本實(shí)驗(yàn)室此前在SK-N-SH細(xì)胞、大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)相同的作用特點(diǎn)[18]。

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是多因素交互作用的結(jié)果，如蛋白聚集、蛋白磷酸化、神經(jīng)元功能缺失和死亡等。Kelvin C.Luk在野生型非轉(zhuǎn)基因鼠注射合成的α-syn纖維，發(fā)現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致病理性α-syn絲氨酸129位磷酸化的細(xì)胞間傳遞，在解剖接近區(qū)域出現(xiàn)帕金森樣Lewy病理。絲氨酸129位磷酸化是α-syn的一種重要的翻譯后修飾形式。蛋白沉積與蛋白磷酸化具有相關(guān)性。α-syn的聚集受α-syn的翻譯后修飾影響[19]。α-syn絲氨酸129位磷酸化在體內(nèi)和體外都通過增加α-syn的聚集而增加其毒性[2]。磷酸化修飾影響α-syn的聚集狀態(tài)[20]并控制其毒性[21]，使磷酸化α-syn成為帕金森病病理過程中的重要節(jié)點(diǎn)[22-23]。PP2A絲蘇氨酸磷酸酶對(duì)于保持α-syn絲氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡極其重要。隨著研究進(jìn)一步深入，環(huán)境因素與帕金森病重要病理成分的相關(guān)性將逐漸被闡明。

魚藤酮是一種線粒體復(fù)合酶Ⅰ抑制劑，影響細(xì)胞呼吸鏈，產(chǎn)生活性氧，對(duì)細(xì)胞造成毒性作用，常被用于復(fù)制帕金森病神經(jīng)毒性模型[24]。本研究顯示，PP2A激動(dòng)劑C2-神經(jīng)酰胺在翻轉(zhuǎn)魚藤酮造成PP2A活性下降的同時(shí)，可一定程度改善魚藤酮造成的細(xì)胞活力下降，提示魚藤酮抑制PP2A活性參與魚藤酮對(duì)細(xì)胞活力的抑制。這可能與PP2A參與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄和翻譯等多種細(xì)胞生命活動(dòng)有關(guān)[25-26]。已有研究表明，某些藥物以PP2A為靶向，激活PP2A能減少魚藤酮誘導(dǎo)的模型鼠運(yùn)動(dòng)障礙，并挽救黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失[27]。

總之，本細(xì)胞學(xué)研究顯示，魚藤酮通過使PP2A催化亞基307位點(diǎn)酪氨酸發(fā)生磷酸化，抑制PP2A活性，PP2A激動(dòng)劑C2-神經(jīng)酰胺可以反轉(zhuǎn)魚藤酮引起的PP2A活性抑制及細(xì)胞活力抑制。進(jìn)一步深入探討帕金森病的環(huán)境危險(xiǎn)因素作用于α-syn的內(nèi)在機(jī)制，將α-syn與PP2A相聯(lián)系，研究魚藤酮的毒性作用，有助于理解PP2A在帕金森病發(fā)病過程中的作用，并發(fā)現(xiàn)潛在的藥物干預(yù)位點(diǎn)。

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