劉俊康， 鄧 渝, 郭林明

(第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系 生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)教研室，重慶 400038)

生物波研究較早地提出了生物耗散與生態(tài)統(tǒng)一機(jī)制等生物波動(dòng)生長(zhǎng)機(jī)制[1]，逐步促成了條件論的理論進(jìn)展[2]。在此理論指導(dǎo)下，研究了體外培養(yǎng)綠膿桿菌生長(zhǎng)的層次狀結(jié)構(gòu)[3]、變形桿菌、酵母菌、大腸埃希菌等的波狀層次生長(zhǎng)特點(diǎn)[4]，以及人膀胱癌細(xì)胞的波狀層次生長(zhǎng)特征[5]，但作為厭氧菌種類的青春雙歧桿菌，其在體外培養(yǎng)，能否在生長(zhǎng)過程中形成波狀層次的結(jié)構(gòu)及對(duì)青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)、生存的意義研究較少，作為腸道重要的生理菌群，深入研究青春雙歧桿菌在各種環(huán)境條件下的生長(zhǎng)特性、生存方式，以此創(chuàng)造更利于雙歧桿菌生長(zhǎng)的條件，保持腸道微生態(tài)平衡具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基、菌種稀釋液及厭氧指示劑 ①改良BS 培養(yǎng)基：多胨18 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉0.5 g，吐溫-80 1 g，L-鹽酸半胱氨酸鹽酸鹽1 g，A液10 mL,B液15 mL，牛肝浸液150 mL，牛腦浸液312.5 mL，牛心浸液462.5 mL，瓊脂20 g，上述成分溶于超純水，定容至1 000 mL。調(diào)pH值至7.2～7.4，分裝，115 ℃無菌滅菌20 min。A液配方：K2HPO42.5 g,KH2PO42.15 g,超純水25 mL；B液配方：MgSO4·7H2O 1 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,NaCl 0.05 g,MnSO40.033 7 g,超純水25 mL。牛腦、牛肝、牛心浸液制備方法：去筋膜，剪碎組織(約1 ～2 mm3)，稱重加雙倍量水(即500 g組織加1 000 mL水)浸泡過夜，去掉表面油脂，45 ℃預(yù)熱1 h，100 ℃水浴鍋加熱1 h后8層紗布過濾，-20 ℃冰箱保存。②菌種稀釋液：KH2PO44.5 g，Na2HPO46 g，L-鹽酸半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，吐溫-80 0.5 g，瓊脂1 g，超純水定容至1 000 mL，115 ℃無菌滅菌20 min，備用。③厭氧指示劑：硼酸二鈉溶液(Na2B4O7·10H2O 2.5 g，美蘭25 mg，酚紅1 mg，超純水400 mL，以上成分混合溶解后，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.0，備用)與瓊脂溶液(瓊脂0.625 g，超純水250 mL)分別加熱煮沸，混勻，分裝安瓿。每安瓿裝1 mL左右，趁熱(溶液為紅色)熔封安瓿。分裝的指示劑在使用前加熱至藍(lán)色消失，即可急速冷卻后放入?yún)捬醐h(huán)境。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Olympus多功能顯微鏡BX41，日本Olympus公司；原子力顯微鏡SP13800N-SPA400，日本精工公司；柯達(dá)數(shù)碼相機(jī)Kodak Easyshre V603，3倍光學(xué)變焦；厭氧培養(yǎng)罐，本室自行設(shè)計(jì)專利產(chǎn)品；冰箱，海爾公司；恒溫培養(yǎng)箱HH.BII500-BS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及菌液制備 將受試菌在BS改良培養(yǎng)基平板上多次轉(zhuǎn)種以保證其純度及選出生長(zhǎng)旺盛、相變能力強(qiáng)的菌株。用菌種稀釋液制成菌懸液，并調(diào)整其濁度，稀釋至1×103個(gè)/mL的細(xì)菌懸液，取50 μL均勻涂布于BS平板上，37 ℃厭氧環(huán)境中(80%N2、10%H2和10%CO2，體積分?jǐn)?shù))連續(xù)培養(yǎng)6 d，平板上長(zhǎng)出10～15個(gè)菌落，菌落直徑為2.5～3 mm(該菌轉(zhuǎn)種可正常生長(zhǎng))。平板取出后裝入原有包袋中并密封，一部分4 ℃冰箱久置，另一部分室溫放置。

1.2.2 菌體形態(tài)觀察 用革蘭染色法觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 原子力顯微鏡樣本收集與檢測(cè) 從菌落半透明環(huán)處取細(xì)菌標(biāo)本，用無菌生理鹽水稀釋，制成200 μL 細(xì)菌懸液。吸取少量細(xì)菌懸液，小心滴于專用玻片上干燥，以甲醇固定15 min，蒸餾水漂洗3次，每次1 min。待干后用原子力顯微鏡在室溫大氣環(huán)境中對(duì)青春雙歧桿菌球形體細(xì)菌形態(tài)特征進(jìn)行掃描觀測(cè)。圖像均在輕敲模式(tapping mode) 下獲得，探針為SIAF01(微懸臂長(zhǎng)200 μm，彈性系數(shù)0.12 N/m)，力常數(shù)為0.2 N/m，掃描參數(shù)為X: 115 μm、Y:115 μm、Z:29.97 μm。按照原子力顯微鏡操作程序掃描觀測(cè)該處青春雙歧桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板菌落觀察

青春雙岐桿菌菌落在4 ℃冰箱久置2～4周，部分菌落先后出現(xiàn)了半透明和透明的明暗交替的序性同心圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，明暗交替3～4次，如圖1A；在菌落凹陷處可見透明環(huán)，如圖1B。而在室溫放置2～4周的青春雙歧桿菌菌落，表面光滑呈土丘狀，未出現(xiàn)明暗交替序性同心圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 青春雙歧桿菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony form of Bifidobacterium adolescentis

2.2 革蘭染色觀察青春雙歧桿菌

在青春雙歧桿菌同心圓環(huán)由內(nèi)到外的不同位置取細(xì)菌標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下觀察到由于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，部分菌體革蘭染色紅色假陰性。不同取菌部位，菌體形態(tài)有明顯的區(qū)別。菌落中不透明圓環(huán)處所取標(biāo)本的青春雙歧桿菌形態(tài)有兩種，一種是染成紫色的球形體，一種是染成紅色的正常形態(tài)，如圖2A；菌落半透明凹陷環(huán)處所取標(biāo)本，青春雙歧桿菌形態(tài)組成有三種，一種是染成紫色的球形體，且其比例較圖2A更多，一種是正常形態(tài)的菌體相變成串珠樣染成紫色的球形體，第三種是少量的正常的菌體形態(tài)，如圖2B。

圖2 青春雙歧桿菌革蘭染色結(jié)果

2.3 原子力顯微鏡掃描觀察青春雙歧桿菌形態(tài)

通過原子力顯微鏡掃描方法，觀察到青春雙歧桿菌在改良BS 培養(yǎng)基上菌體從桿狀變成了串珠狀球形體(圖3A)，其直徑在1～2 μm(圖3B)，觀察球形體表面，發(fā)現(xiàn)菌體表面粗糙不平(圖3C)。

圖3 原子力顯微鏡掃描青春雙歧桿菌結(jié)果Fig.3 Atomic force microscope scan results of Bifidobacterium adolescentis

3 討 論

在有關(guān)細(xì)菌等波狀層次生長(zhǎng)特征的研究基礎(chǔ)上[6]，本研究發(fā)現(xiàn)作為嚴(yán)格厭氧菌的雙岐桿菌生長(zhǎng)的波狀層次結(jié)構(gòu)。近年來環(huán)境壓力導(dǎo)致的細(xì)菌菌體形狀改變研究較多，例如幽門螺桿菌在氧脅迫下的球形變異[7]，以及奇異變形桿菌在抗生素條件下的球形變異[8]等。青春雙歧桿菌在波狀層次生長(zhǎng)過程中也出現(xiàn)了菌體多點(diǎn)斷裂增殖的現(xiàn)象，產(chǎn)生了球形體，這與之前在青春雙歧桿菌菌落的自溶環(huán)內(nèi)出現(xiàn)了球形體的觀察一致[9]，而本研究觀察到4 ℃冰箱久置的青春雙歧桿菌菌落出現(xiàn)了波狀層次生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，而且產(chǎn)生了更大的自溶環(huán)，并交替出現(xiàn)，自溶環(huán)內(nèi)的菌體生存形態(tài)多為球形體，其次出現(xiàn)了菌體斷裂增殖，而正常的菌體形態(tài)較少。不透明圓環(huán)中主要是正常形態(tài)的菌體，可推測(cè)此處的增殖方式為正常的二分裂增殖。而常溫下放置的青春雙歧桿菌菌落沒有出現(xiàn)自溶環(huán)。說明青春雙歧桿菌菌體能通過生長(zhǎng)、生存的菌體形態(tài)改變，以及增殖方式改變對(duì)環(huán)境變化做出響應(yīng)，且該過程可能是細(xì)菌生命活動(dòng)本身(代謝產(chǎn)物)引起的生長(zhǎng)環(huán)境變化和培養(yǎng)過程中環(huán)境條件(培養(yǎng)基)動(dòng)態(tài)改變的雙重作用，進(jìn)而誘導(dǎo)了青春雙歧桿菌這種波狀層次生長(zhǎng)在低溫久置條件下顯現(xiàn)出來，這對(duì)青春雙歧桿菌適應(yīng)環(huán)境變化、維持種系穩(wěn)定有何重要意義，為什么菌體在透明環(huán)處特殊的微生態(tài)環(huán)境條件容易自溶，以及自溶的意義，需要進(jìn)一步深入研究。

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