蔣 維， 秦王閣閣， 孔玉珊， 李 輝， 薛艷紅， 劉士平

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

植物內(nèi)生菌(endophyte)是一類生活于健康植物組織或器官內(nèi)部的微生物[1]，近年來研究表明，內(nèi)生菌不僅分布廣泛，有極高的多樣性[2]，而且經(jīng)過漫長的“協(xié)同進(jìn)化”后，其發(fā)酵產(chǎn)物種類豐富，生物活性廣泛，是開發(fā)新型天然產(chǎn)物的重要來源[2]，成為微生物學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)一個(gè)備受關(guān)注的交叉熱點(diǎn)[1-2]。疏花水柏枝(Myricarialaxiflora)是一種特異分布在三峽消落帶地區(qū)的瀕危植物[3]，每年要承受4～6個(gè)月的淹水脅迫[3]。淹水會導(dǎo)致供氧量減少，隨后發(fā)生的不完全氧化將影響植物體正常的生長發(fā)育[4]。在這特殊生境的脅迫下，疏花水柏枝經(jīng)過常年的進(jìn)化，形成了一套抗氧化脅迫機(jī)制來應(yīng)對。如：從疏花水柏枝中分離出一種叫3,4-二甲氧基-5-羥基苯甲酸甲酯的物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗氧化能力[5]。其內(nèi)生真菌資源豐富[6]，且具備極強(qiáng)的抗氧化能力[6]。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室在疏花水柏枝的根部分離到1株內(nèi)生煙曲霉(Aspergillusfumigatus)，其發(fā)酵液粗提物的抗氧化活性達(dá)到同濃度維生素C的30%[7]，暗示內(nèi)生菌通過強(qiáng)抗氧化能力在疏花水柏枝長期對抗水淹脅迫的生態(tài)適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。針對在寄主經(jīng)受氧化脅迫分離的內(nèi)生菌是否具有高抗氧化活性這一化學(xué)生態(tài)學(xué)的問題，本研究從疏花水柏枝分離的一株經(jīng)初篩具高抗氧化活性內(nèi)生真菌出發(fā)，對其進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)合體外和體內(nèi)的方法，對發(fā)酵液提取物及其主成分的抗氧化能力進(jìn)行了綜合評價(jià)，并提出了可能的作用機(jī)理，這些研究將為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用和天然抗氧化劑的篩選與研發(fā)提供了參考，同時(shí)對明確特殊生境下內(nèi)生真菌與宿主的化學(xué)生態(tài)學(xué)關(guān)系有一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株QY-1分離自淹水前疏花水柏枝的葉片中，適度厭氧條件下獲得[6]，4 ℃石蠟保藏。后期的研究發(fā)現(xiàn)QY-1在正常有氧狀態(tài)下也可生長，故在實(shí)驗(yàn)中采用正常的有氧培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、LB、DMEM/F-12 完全培養(yǎng)基等[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分子鑒定 將4 ℃保藏的QY-1接種于PDA固體培養(yǎng)基中，具體鑒定辦法參照高媛等[7]的辦法進(jìn)行。將獲得的序列采用Mega5.0軟件進(jìn)行多重對比，用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 分離提取及胞外抗氧化能力測定 菌株的PDA發(fā)酵液直接用總抗氧化試劑盒(T-AOC，南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定[6]。其粗提物分別采用DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法[9-10]和鐵氰化鉀(Potassium Ferricyanide，PF)還原力測定法[9-10]測定其抗氧化能力，各重復(fù)3次，以相同濃度的維生素C作為正對照。粗提方法：將QY-1于200 mL (500 mL錐形瓶) PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，然后將菌懸液通過真空抽濾裝置過濾，得菌體與發(fā)酵液。菌體用70%丙酮常溫浸提24 h，浸提3次，超聲1.5 h，過濾菌絲，55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥得菌體相粗提物。發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次得酯相和水相，分別在45 ℃和40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥合并得到發(fā)酵液粗提物。將QY-1 粗提物用甲醇溶解后，選用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(甲酸)=7∶3∶0.1進(jìn)行薄層色譜，獲得一主物質(zhì)SF2，抗氧化能力分析同前。

1.2.3 胞內(nèi)抗氧化作用分析 為進(jìn)一步確定QY-1代謝物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的活性，分別以原核生物代表(大腸埃希菌DH5α)、真核生物人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y為測試對象，分別建立了200 μmol/L 和800 μmol/L的H2O2氧化損傷模型，測定其粗提物對過氧化氫的損傷保護(hù)作用。先將大腸埃希菌在LB培養(yǎng)基中37 ℃、100 r/min培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的發(fā)酵液粗提物，培養(yǎng)12 h后，加入濃度為200 μmol/L 的H2O2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用分光光度計(jì)測定其在600 nm的吸光值，計(jì)算大腸埃希菌細(xì)胞的存活率，以1 mg/mL的維生素C做正對照。抑制率(%)=((正常生長下的吸光值-處理下的吸光值)/正常生長下的吸光值)×100%。神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用參照Huang等[8]的方法進(jìn)行，用MTT法測細(xì)胞存活率。乳酸脫氫酶(LDH)滲漏率檢測時(shí)將QY-1粗提物的濃度控制在1 000 μg/mL，具體按照試劑盒(Biovision，美國)提供的方法進(jìn)行；凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9及SOD(超氧化物歧化酶)的活性檢測使用碧云天生物技術(shù)公司試劑盒，具體方法見產(chǎn)品使用說明。所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次，通過spss19.0統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌菌株QY-1的鑒定

內(nèi)生真菌QY-1分離自疏花水柏枝淹水前厭氧條件下的葉片中，菌落在PDA上生長緩慢，初期菌落為白色絨毛狀，漸變成暗青色，里層顏色較深，呈黃褐色，菌絲呈放射狀(圖1A)，背面為米黃色，菌落難以挑起，液體發(fā)酵溶液較深，呈黃褐色，菌絲無色透明，有分支和隔膜(圖1B)，近球形的子囊殼散生或群生(圖1C)。

圖1 QY-1的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及分子鑒定Fig.1 Morphology of colony, hyphae & conidia and molecular characterization of QY-1A：菌落形態(tài)；B：顯微形態(tài)；C：子囊殼；D：基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹A: Morphology of colony; B: Back of the dish; C: Micromorphology；D：Phylogenetic tree

將QY-1的總DNA提取后，以其為模板，使用通用上游引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約600 bp的片段，回收后在上海瑞迪生物科技有限公司測序，其18S rDNA的ITS序列通過EditSeq軟件拼接，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號為KU954091)中進(jìn)行BLAST比對和同源性分析，并采用Mega 5.0軟件，用N-J法建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1D)。結(jié)果表明，菌株QY-1 18S rDNA的ITS序列與球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)的序列相似性為100%，對照《真菌鑒定手冊》[11]，比較分析QY-1和球毛殼菌的形態(tài)特征，判斷QY-1是1株球毛殼菌。

2.2 QY-1在細(xì)胞外的抗氧化能力

在初篩時(shí)菌株QY-1就顯示出極強(qiáng)的胞外抗氧化能力，其發(fā)酵液的總抗氧化活力(T-AOC) 達(dá)到55.90 U/mL, 遠(yuǎn)高于分離自山東泰安的青檀葉片中球毛殼菌No.81(其總抗氧化能力為16.12 U/mL[12],表1)，而且在本實(shí)驗(yàn)室從疏花水柏枝分離的163株內(nèi)生真菌中(平均總抗氧化活力6.22 U/mL)，QY-1的抗氧化能力是最高的(表1)。將QY-1的發(fā)酵產(chǎn)物抽提后，將菌體相和發(fā)酵液相的物質(zhì)分別配成1 mg/mL溶液，利用T-AOC試劑盒測定其總抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是菌體還是發(fā)酵液都含有大量的抗氧化物質(zhì)(表1)，雖然QY-1在菌體相的抗氧化活性要高一些，但是由于菌體干物質(zhì)量少(0.1～0.2 mg/100 mL)，所以后期實(shí)驗(yàn)采用發(fā)酵液來評價(jià)QY-1的抗氧化活性。用三種方法分析比較了QY-1發(fā)酵液提取物的抗氧化能力，結(jié)果表明不論是自由基清除率、總抗氧化活力，還是鐵氰化鉀還原力，QY-1都表現(xiàn)得非常出色，說明QY-1的提取物有著比較全面的抗氧化能力，達(dá)到同等濃度維生素C的50%水平。

表1 QY-1在細(xì)胞外的抗氧化能力

注：a：從疏花水柏枝中分離的163個(gè)內(nèi)生真菌高抗氧化活性的平均值；b：粗提物和Vc的濃度均為1 mg/mL；“-”表示未測定

2.3 QY-1在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力

為進(jìn)一步評價(jià)QY-1粗提物的抗氧化活性，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的大腸埃希菌和人神經(jīng)母瘤細(xì)胞的過氧化氫損傷模型，檢測其是否對原核細(xì)胞和真核細(xì)胞具有氧化損傷保護(hù)作用。表2分析了QY-1的發(fā)酵液粗提物對大腸埃希菌的氧化損傷保護(hù)作用。質(zhì)量濃度為10 mg/mL的提取物可以促進(jìn)大腸埃希菌的生長，說明QY-1的粗提物對細(xì)胞生長沒有毒害，反而有促進(jìn)增殖作用。在200 μmol/L 的H2O2存在下，大腸埃希菌的生長明顯受到抑制，抑制率達(dá)到55.39%，但是這種抑制效應(yīng)在加有QY-1提取物時(shí)能夠完全避免(表2)，2 mg/mL的QY-1提取物的保護(hù)效果達(dá)到1 mg/mL維生素C的50%。在2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著提取物濃度增高大腸埃希菌細(xì)胞的存活率不斷提高，將H2O2的抑制效應(yīng)逐漸縮小。

表2 QY-1粗提物對大腸埃希菌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

需要指出的是，這種保護(hù)作用不能排除是由于QY-1粗提物促進(jìn)原核細(xì)胞增殖所致(表2)，因?yàn)樵诓患親2O2時(shí)，效果也很明顯。為了進(jìn)一步明確QY-1粗提物對真核細(xì)胞是否具有氧化損傷保護(hù)作用，選用人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y，測定了在800 μmol/L的H2O2存在下細(xì)胞的存活率(圖2)。結(jié)果表明QY-1的粗提物對神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷具有較好的保護(hù)效果，在1 000 μg/mL濃度時(shí)，細(xì)胞存活率提高了63.6%(圖2A)，但是在2 000 μg/mL時(shí)，保護(hù)作用卻大幅下降，這一方面說明QY-1的粗提物對真核細(xì)胞同樣具有抗氧化作用，另一方面也反映了對大腸埃希菌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞而言所需求的最佳濃度不一致。

為了明確QY-1的粗提物對神經(jīng)細(xì)胞抗氧化保護(hù)的可能機(jī)理，測定了其在氧化損傷狀態(tài)下乳酸脫氫酶(LDH)的酶活。LDH是評價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，氧化損傷將導(dǎo)致LDH從細(xì)胞內(nèi)滲漏到細(xì)胞液中[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，800 μmol/L的H2O2處理將會嚴(yán)重破壞神經(jīng)細(xì)胞膜的完整性，使得LDH滲漏到細(xì)胞液的漏出率達(dá)正常細(xì)胞的12倍(圖2B)，但是在添加QY-1的粗提物后，這種滲漏作用得到有效緩解，與經(jīng)H2O2刺激過的細(xì)胞相比，LDH滲透率降低了81.5%，說明QY-1可以降低因H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用(圖2B)。

圖2 QY-1的粗提物對神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y的氧化損傷保護(hù)Fig.2 Protective effects of QY-1 crude extract to nerve cells SH-SY5Y undergoing oxidative damageA：QY-1的粗提物對H2O2存在下神經(jīng)細(xì)胞生長的影響；B：QY-1的粗提物對神經(jīng)細(xì)胞LDH滲漏率影響；a、b、c表示Dumcan法測定的顯著性差異(P<0.05)，3次重復(fù)A: The growth influence of nerve cells to QY-1 crude extract under H2O2 stress; B: LDH leakage rate affected by QY-1 crude extract; a, b and c means significant difference by Duncan test with P<0.05, n=3

2.4 QY-1的主成分分離及對神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用

將所獲得的QY-1 粗提物用甲醇溶解，薄層色譜后分離得到一主要物質(zhì)，命名為SF2(圖3A)，物質(zhì)結(jié)構(gòu)正在鑒定中。為了尋找到合適的藥物濃度范圍，先將上述單體配制成6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，添加800 μmol/L的H2O2溶液繼續(xù)處理8 h，用MTT法測定細(xì)胞存活率。結(jié)果表明25～100 μg/mL的SF2傷害最小(表3)，選擇該濃度進(jìn)行抗氧化保護(hù)作用分析。在25 μg/mL時(shí)對神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷具有較好的效果(表3)，將神經(jīng)細(xì)胞在H2O2脅迫下的相對存活率提高了58.6%。

表3 SF2對神經(jīng)細(xì)胞的毒性及抗氧化保護(hù)作用

注：*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01, n=3)；“-”表示未測定

為進(jìn)一步分析SF2對神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)理，實(shí)驗(yàn)分別測定了SH-SY5Y細(xì)胞在SF2 6.25 μg/mL處理下的LDH、SOD、Caspase 3、Caspase 9的酶活表達(dá)情況。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到H2O2氧化損傷后，LDH滲出率升高、SOD酶活降低、凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9活性增高(圖3)。雖然SF2對降低細(xì)胞的LDH滲漏率、保護(hù)細(xì)胞膜完整性作用并不明顯(圖3B)，對SOD抗氧化酶的酶活增加也不顯著(圖3C)，但是SF2卻可以極顯著地抑制凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的表達(dá)(圖3D、E)，說明SF2可能通過抑制凋亡蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。

圖3 SF2的分離及對神經(jīng)細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用的可能機(jī)理Fig.3 Isolation of SF2 and the possible mechanism to nerve cells in antioxidant protectionA: SF2的分離；B：LDH滲出率；C：SOD酶活；D：Caspase 3酶活；E：Caspase 9酶活；**表示極顯著差異P<0.01, n=3A: Isolation of SF2; B: LDH leakage rate; C: SOD enzyme activity; D: Caspase 3 enzyme activity; E: Caspase 9 enzyme activity; ** means very significant difference with P<0.01, n=3

3 討 論

近年來，植物內(nèi)生真菌成為一種新型天然藥物的重要來源[1-2]。本研究從能耐受低氧脅迫的植物疏花水柏枝一株具高抗氧化活性的內(nèi)生真菌QY-1為研究對象，對其進(jìn)行了生物學(xué)鑒定和抗氧化能力分析。結(jié)果表明QY-1是一株球毛殼菌，而且不管在胞外還是胞內(nèi)，都表現(xiàn)出很高的抗氧化水平。其粗提物可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞膜的完整性，減低乳酸脫氫酶的滲漏率。從粗提物中分離到一種主成分SF2，可有效抑制H2O2脅迫下凋亡蛋白Caspase 3和Caspase 9的活性，這一系列研究結(jié)果表明，球毛殼菌QY-1具備較強(qiáng)的抗氧化能力，是一種具有潛在開發(fā)價(jià)值的抗氧化劑資源。

隨著社會生活的進(jìn)步，人類對新型抗氧化劑的研發(fā)提出了更多要求，越來越多的抗氧化劑用在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域[9-10]。但是當(dāng)前還沒有一種通行的標(biāo)準(zhǔn)方法來準(zhǔn)確評價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，不同的方法可能有其局限性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差較大[9-10]。限制了抗氧化研究的進(jìn)一步發(fā)展。本研究結(jié)合3種體外測定方法和2種體內(nèi)測定方法來評價(jià)抗氧化活性，取得了較好的效果，也進(jìn)一步證實(shí)了QY-1的高抗氧化能力。

我們發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)細(xì)胞遭受H2O2氧化損傷后，凋亡蛋白Caspase 3活性的增強(qiáng)程度明顯高于Caspase 9，暗示Caspase 3在神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷時(shí)發(fā)揮著更大的作用。QY-1生產(chǎn)的主物質(zhì)SF2，既可抑制Caspase 3，又可抑制Caspase 9的活性，暗示SF2可能通過抑制Caspase 3的活性來達(dá)到抗氧化保護(hù)作用，而可能通過抑制Caspase 3和Caspase 9的活性來達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果。

在分類學(xué)上，球毛殼菌屬于子囊菌亞門(Aseomyeotina)、球殼目(Sphaeriales)、黑孢殼科 (Melanosporaceae) 和毛殼菌屬(Chaetomium)[14]，是一種應(yīng)用極為廣泛的生防菌[15]。研究表明，球毛殼菌可通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)[16]、競爭性抑制植物病原菌的生長[17]、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[18]等作用。本實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)QY-1可以有效抑制柑橘橘青霉(Penicilliumcitrinum)的生長，從而達(dá)到柑橘生物保鮮的效果[19]。球毛殼菌是否通過產(chǎn)生高抗氧化物質(zhì)來誘導(dǎo)物種發(fā)生氧化爆發(fā)從而起到光譜抗性，將是未來極有意義的一個(gè)研究方向。

本研究通過QY-1的提取分離，獲得了一種主成分SF2，對神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷起到一定的保護(hù)效果。但是值得說明的是，QY-1的粗提物與主成分SF2的作用機(jī)理是不一致的，如粗提物可以明顯抑制LDH滲漏到胞質(zhì)，可是SF2卻喪失了此能力，說明在QY-1的粗提物中還存在一些其他的抗氧化物質(zhì)。未來的實(shí)驗(yàn)一方面要進(jìn)行SF2鑒定，另一方面需進(jìn)一步明確QY-1起抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，根據(jù)活性跟蹤的方法獲得高抗氧化活性的化合物，為進(jìn)一步研發(fā)新型抗氧化劑提供參考。

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