郭存蘭，李 壯

(中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所 電分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，吉林 長春 130022)

1986年，Binnig等人發(fā)明了原子力顯微鏡(A-tomic Force Microscope，簡稱 AFM)［1］。原子力顯微鏡是通過尖細(xì)針尖對樣品表面進(jìn)行掃描來獲取測量信息。因其高分辨的觀測能力(可達(dá)原子級)和高靈敏的檢測能力(可達(dá)皮牛級)，原子力顯微鏡自發(fā)明以來，已被廣泛用于表面科學(xué)、材料科學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域。

圖1 原子力顯微鏡在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用［2］

盡管最初設(shè)計只是為了觀測非導(dǎo)體表面，實(shí)踐證明原子力顯微鏡適用于任何微觀的表面，甚至是生物樣品。和其它同類技術(shù)相比較，原子力顯微鏡在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作，十分適合生物體系的研究。發(fā)展迄今，原子力顯微鏡已被應(yīng)用于生物研究的各個領(lǐng)域，展示了其廣泛的應(yīng)用前景［2］。相關(guān)研究工作也已在諸多的綜述文章和書籍得到了很好地總結(jié)和述評［2－8］。因此，本綜述將通過總結(jié)我們及其他研究小組的研究工作，較全面系統(tǒng)地總結(jié)原子力顯微鏡成像和力譜技術(shù)在生物研究中取得的一些新進(jìn)展，并對該技術(shù)的發(fā)展前景做一簡要的展望和預(yù)測。

1 原子力顯微鏡成像和力譜簡介

因為本文將主要討論成像和力譜這兩種技術(shù)在生物研究中的應(yīng)用，因此這里先對其做一概述［4，7，9］。

1.1 原子力顯微鏡成像

原子力顯微鏡是利用原子間的微弱作用力(主要是范德華作用力)來成像。原子力顯微鏡的納米級探針被固定在一個對力極敏感的可操控的微米級彈性懸臂上。當(dāng)探針靠近樣品時，探針頂端的原子與樣品表面原子間的范德華作用力會使懸臂發(fā)生形變，偏離原來的位置。根據(jù)掃描樣品時探針的偏移量或改變的振動頻率重建三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌。根據(jù)探針和樣品間作用力的不同，原子力顯微鏡可以采用接觸模式(contact mode)、輕敲模式(tapping mode)和非接觸模式(noncontact mode)進(jìn)行成像。生物樣品成像時，絕大多數(shù)采用輕巧模式。這種模式下，針尖間歇式輕微敲擊樣品表面。由于針尖和樣品的接觸時間短，能很大程度地減小針尖側(cè)向力對生物樣品的破壞。和其他具有類似分辨率的成像技術(shù)相比，原子力顯微鏡不僅樣品制備簡單，而且可在真空、空氣和溶液(接近生理條件)等不同介質(zhì)中成像，因而特別適用于生物體系的研究。

1.2 原子力顯微鏡力譜

原子力顯微鏡力譜(力－距離曲線)，即針尖－樣品相互作用力隨針尖－樣品距離變化的曲線。實(shí)驗中，當(dāng)探針相對樣品垂直來回移動時(沿Z方向)，記錄微懸臂偏轉(zhuǎn)方向和程度隨針尖－樣品距離的變化，再依據(jù)胡克定律將微懸臂的變化換算成對應(yīng)的相互作用力，便得到力曲線。如將相互作用的兩組分分別固定在基底和探針表面，則由測量力譜可以獲取二者相互作用親和力的大小(比如斷開受體－配體、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、互補(bǔ)的DNA鏈等相互作用的分子所需的力)。如將同一組分的兩端分別固定于基底和探針表面，則能夠獲取此組分各個亞單元相互作用的信息。

下面將分別介紹此兩類技術(shù)在研究各類生物分子中的應(yīng)用。生物分子將涵蓋核酸、蛋白質(zhì)、磷脂、多糖、細(xì)胞以及病毒等。

2 核酸

2.1 脫氧核糖核酸(DNA)

2.1.1 成像

DNA是最早用于原子力顯微鏡成像的生物分子之一。當(dāng)DNA分子以適當(dāng)?shù)姆椒ü潭ㄔ诨咨虾?，可以用原子力顯微鏡來觀察其形貌甚至其螺旋結(jié)構(gòu)。Shao研究小組在陽離子雙層磷脂膜修飾基底上緊密有序地固定DNA分子，不僅得到了有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA高分辨圖像，還測得了與理論值相符的DNA螺距［10］。我們研究小組利用原子力顯微鏡高分辨成像技術(shù)，深入開展了DNA及DNA與其它分子(物質(zhì))相互作用的可視化研究［11－45］。關(guān)于我們研究組工作的早期總結(jié)，請參閱專著［4］。通過系統(tǒng)地比較各種基底(比如玻璃、金(111)、云母等)、基底修飾層、金屬離子等的影響，我們改進(jìn)和發(fā)展了DNA(包括單雙鏈DNA、質(zhì)粒DNA及DNA與其它分子的復(fù)合物等)樣品的制備方法，獲得了系列高質(zhì)量圖像［13，14，17，18，21，27，34］。我們研究了二價金屬離子和3－氨丙基三乙氧基硅烷對液相DNA成像的影響，發(fā)現(xiàn)Ni2+和3－氨丙基三乙氧基硅烷均能夠起到很好固定 DNA的作用(圖2)［22］。通過 DNA分子在水中的擴(kuò)散和重排，我們在云母表面成功制備了高度有序的、具有指紋形結(jié)構(gòu)的DNA單層膜(圖3)［27，34］。不同條件下 DNA 長度的變化反映了其構(gòu)型的相應(yīng)變化［17，46］。通過比較不同條件下DNA的長度，我們發(fā)現(xiàn)堿土金屬離子能不同程度地誘導(dǎo)DNA從B到A構(gòu)型的變化(圖4)［17］。通過比較不同堿基組成的DNA的長度，Borovok等則發(fā)現(xiàn)poly(dG)－poly(dC)吸附在云母表面時近似于A構(gòu)型，而poly(dA)－poly(dT)和質(zhì)粒DNApUC19采取了 B 構(gòu)型［46］。

圖2 云母基底上DNA的液相原子力顯微鏡圖像:(A－B)分別為Ni2+固定的pBR322 DNA和pBR322/pst I，(C－D)分別為3－氨丙基三乙氧基硅烷固定的 pBR322 DNA 和 pBR322/ps t I［22］

圖3 樣品在超純水中孵育不同時間形成的DNA膜的原子力顯微鏡圖像:(a)0 s，(b)40 s，(c)5 min，(d)30 min，和(f)60 min。(e)是(d)的放大圖。圖的垂直高度分布分別為(a)10 nm，(b)5 nm和(c－f)3 nm。DNA 濃度為 12.5ng/μL，Mg2+濃度為 1.0 mM［27］

圖4 2 mM不同堿土金屬離子存在下pBR322 DNA的原子力顯微鏡圖像［17］上圖為10%乙醇溶液;下圖為20%乙醇溶液。標(biāo)尺為200 nm

在生物體內(nèi)，線性雙螺旋DNA會進(jìn)一步扭曲纏繞成更復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)。環(huán)形DNA分子繞曲后將以超螺旋形式存在。在DNA復(fù)制時，會形成三向結(jié)(three－way junctions)結(jié)構(gòu)的復(fù)制叉;而在DNA重組時，則會產(chǎn)生四向結(jié)(four－way junctions)的特殊結(jié)構(gòu)。因而研究不同構(gòu)象DNA的結(jié)構(gòu)特性，對理解其分子生物學(xué)機(jī)制具有重要的意義。通過原子力顯微鏡成像，則可以直觀的區(qū)分不同構(gòu)象的DNA。圖5給出了三種不同DNA構(gòu)象的原子力顯微鏡圖像［47－49］。由于采用正電荷修飾的基底，圖 5 中DNA采取了三維到二維的投影構(gòu)象，均反映了DNA在溶液中的最初構(gòu)象。

圖 5 (A)超螺旋 DNA［47］、(B)三向結(jié) DNA［48］、(C)四向結(jié)DNA［49］的原子力顯微鏡圖像

除DNA的天然結(jié)構(gòu)外，原子力顯微鏡還被用于研究各類DNA人工納米結(jié)構(gòu)。Seeman及其合作者在此研究領(lǐng)域進(jìn)行了深入、開拓性的研究。圖6給出了一個例子，顯示了由菱形DNA單元組裝所得二維陣列的圖像［50］。隨著DNA折紙術(shù)(origami)的誕生［51］，研究人員用原子力顯微鏡掃描得到了諸如“笑臉”的各種圖案。最近，Song等人將控溫原件裝置在壓電掃描管上，原位、實(shí)時地觀察到了DNA折紙結(jié)構(gòu)的自組裝和解離［52］。該工作不僅有助于加深理解DNA折紙結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特性，也為研究其他生物體系的熱響應(yīng)性能奠定了基礎(chǔ)。

圖6 菱形結(jié)構(gòu)DNA組裝體的原子力顯微鏡圖像［50］

除用于DNA自身成像外，原子力顯微鏡還可用于研究DNA和其他物質(zhì)的相互作用。DNA與金屬離子、生物小分子、聚合物、蛋白質(zhì)等的相互作用，在傳感器設(shè)計、藥物篩選、基因輸運(yùn)、生物物理、材料制備等基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用方面都有重要的意義。

Piétrement等人通過原子力顯微鏡研究了抗癌藥物博來霉素導(dǎo)致的DNA剪切，結(jié)果表明帶正電荷的表面可以明顯抑制博來霉素對DNA的剪切作用［53］。我們研究了 DNA －Co(phen)33+復(fù)合物在乙醇－水混合體系中結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的行為(圖7)［16］。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，DNA－Co(phen)33+復(fù)合物加入乙醇時能夠誘導(dǎo)其相貌變化。在適合乙醇濃度下，復(fù)合物可形成圓環(huán)結(jié)構(gòu)。Guo等人結(jié)合原子力顯微鏡和其他表征手段，研究了DNA和多巴胺的相互作用［40］。結(jié)果表明多巴胺能夠誘導(dǎo)環(huán)形DNA凝集，在云母表面形成小的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所得環(huán)狀結(jié)構(gòu)的尺寸可以通過多巴胺的濃度來調(diào)節(jié)(圖8)。此研究提供了一種控制DNA凝集體尺寸和形貌的新方法，為其在基因轉(zhuǎn)染、材料科學(xué)和納米技術(shù)等方面的應(yīng)用提供了有用的信息。

圖7 DNA－Co(phen)33+復(fù)合物在不同的乙醇－水體系中的原子力高度圖:(a)無乙醇，(b)10%乙醇，(c)20%乙醇，(d)30% 乙醇，(e)62% 乙醇，(f)80% 乙醇［4，16］

圖8 環(huán)形DNA和不同濃度多巴胺相互作用的原子力顯微鏡圖［40］。多巴胺的濃度依次為(a)500 μM，(b)100 μM，(c)50 μM，(d)7.5 μM，(e)5 μM。z 方向高度為 10 nm。(f)DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的周長和高度隨多巴胺濃度變化的關(guān)系圖

荷正電分子能中和DNA磷酸骨架上的負(fù)電荷，使其收縮成緊密有序結(jié)構(gòu)，形成DNA凝集。一般認(rèn)為，當(dāng)DNA上約90%的負(fù)電荷被抵消時，就能發(fā)生凝集。Liu等人用原子力顯微鏡研究了一含有－環(huán)糊精基團(tuán)的新型釕配合物誘導(dǎo)的DNA凝集［54］。研究表明可以通過調(diào)節(jié)配合物和DNA的配比來調(diào)控凝聚體的尺寸和形貌。隨著配合物濃度的增加，自然鋪展的DNA會經(jīng)過帶有空隙的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及實(shí)心的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最終形成球形聚集體。除多價陽離子復(fù)合物外，陽離子聚合物是比較常用的凝集試劑。比如在聚乙烯亞胺誘導(dǎo)下，DNA可凝集形成典型的環(huán)狀和棒狀結(jié)構(gòu)［55］。

原子力顯微鏡也被廣泛用來研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用。這些研究可以提供DNA－蛋白質(zhì)復(fù)合物的尺寸和形貌、蛋白質(zhì)在DNA上的分布信息以及蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的DNA構(gòu)象變化。Ristic等人通過原子力顯微鏡觀察到了人的Rad54蛋白質(zhì)和有裂口的質(zhì)粒DNA相互作用的超螺旋結(jié)構(gòu)，并籍此提出了Rad54沿DNA雙鏈運(yùn)動的模型［56］。作為代表性的重組酶，RecA蛋白質(zhì)與DNA的相互作用得到了深入地研究。利用原子力顯微鏡可以直接觀察RecA與DNA形成核蛋白絲的形貌及動力學(xué)。Sattin等人通過原子力顯微鏡對不同作用時間的產(chǎn)物成像，直觀地研究了核蛋白絲通過成核和生長這兩個步驟進(jìn)行組裝的機(jī)理［57］。其后續(xù)工作進(jìn)一步研究了RecA蛋白從雙鏈DNA上分解的過程［58－60］。利用原子力顯微鏡，我們小組系統(tǒng)地研究了不同溶液條件中已經(jīng)形成的核蛋白絲在低溫下發(fā)生的形貌變化［37］。此工作有助于進(jìn)一步理解影響RecA蛋白的穩(wěn)定性以及RecA和DNA相互作用的相關(guān)因素。我們進(jìn)而用原子力顯微鏡在體外研究了聚賴氨酸對DNA－RecA核蛋白絲的影響(圖9)［39］。試驗結(jié)果表明核蛋白絲的形貌隨著聚賴氨酸的濃度、分子長度和加入順序的變化而變化。不同條件下核蛋白絲形貌的區(qū)別，為研究核蛋白絲形成過程中DNA的構(gòu)象變化以及RecA和DNA作用的鍵合位點(diǎn)提供了信息。

圖9 原子力顯微鏡研究聚賴氨酸引起的DNA凝集對DNA－RecA復(fù)合物的影響［39］

我們對原子力顯微鏡制作DNA高分辨物理圖進(jìn)行了深入地研究［4］。DNA高分辨物理圖是指利用各種分子生物學(xué)技術(shù)手段通過對DNA分子的檢測實(shí)現(xiàn)特征序列的準(zhǔn)確定位。相對于傳統(tǒng)的熒光原位雜交等DNA物理作圖方法而言，原子力顯微鏡可以直接測量DNA分子的長度，以及確定與其相結(jié)合的其它分子。利用原子力顯微鏡有望發(fā)展一種簡單、快速、準(zhǔn)確、高效的分析工具，用于大片段DNA高分辨物理圖譜制作。

圖10 Co(phen)33+存在下，限制性內(nèi)切酶EcoRI在星號活力位點(diǎn)與pBR322 DNA結(jié)合圖及與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照圖［4］

通過優(yōu)化實(shí)驗條件，我們發(fā)現(xiàn)Co(phen)3+能3夠促使限制性內(nèi)切酶結(jié)合在DNA分子的星號活力位點(diǎn)上，卻不會對DNA進(jìn)行切割。圖10給出了Co(phen)33+存在下，限制性內(nèi)切酶EcoRI的星號活力位點(diǎn)圖譜。圖譜顯示了6個酶結(jié)合位點(diǎn)(理論上有16個結(jié)合位點(diǎn)，即1個正常位點(diǎn)和15個星號活力位點(diǎn))。盡管原子力顯微鏡成像方法給出的位點(diǎn)偏少，但是準(zhǔn)確度很高(最大的偏差為2.2%，相當(dāng)于90 pb長度的DNA序列;平均偏差為0.8%，相當(dāng)于37 pb長度的DNA序列)。

圖11 Co(phen)33+存在下，限制性內(nèi)切酶 EcoRI與pCAT DNA 結(jié)合圖［4］

圖12 Co(phen)33+存在下，限制性內(nèi)切酶DraI與環(huán)狀DNApBR 322結(jié)合圖(a)，限制性內(nèi)切酶PvuII與線性DNAp-BR322/Pst I結(jié)合圖(b)，限制性內(nèi)切酶 BamHI與線性DNApBR322/Pst I結(jié)合圖［4］

此方法還可用于獲取其它DNA的限制性內(nèi)切酶EcoRI的星號活力位點(diǎn)圖譜(圖11)。我們進(jìn)一步的研究還表明，該方法也同樣適用于獲取其它限制性內(nèi)切酶和DNA作用的星號活力圖譜，證明了方法的普適性(圖12)。

近來，研究人員將DNA納米技術(shù)和高速原子力顯微鏡相結(jié)合，發(fā)展了研究DNA－蛋白質(zhì)相互作用的新策略。利用DNA折紙術(shù)，可以準(zhǔn)備結(jié)構(gòu)精確可控的DNA(比如特定長度和張力的DNA);而新近發(fā)展的高速原子力顯微鏡則因其快速成像的能力可實(shí)時跟蹤反應(yīng)過程。Sugiyama研究小組借助納米圖案化結(jié)構(gòu)，通過改變長度實(shí)現(xiàn)了雙鏈DNA張力的精確調(diào)控［61］。實(shí)驗結(jié)果證明，64mer雙鏈DNA因受力處于緊繃狀態(tài)，因而盡管可以結(jié)合EcoRI甲基化轉(zhuǎn)移酶卻不能被甲基化;而74mer雙鏈DNA則處于松弛狀態(tài)，能滿足甲基化反應(yīng)時DNA局部彎曲的需求故能被甲基化。他們后來又將該方法應(yīng)用于DNA烷基化的研究［62］。這一方法為研究DNA－蛋白質(zhì)以及其他分子相互作用提供了新的思路。

3.1.2 力譜

拉伸單個DNA分子所需的力一般在pN到nN之間［63］。而用原子力顯微鏡能夠獲得5pN分辨率的力譜，故原子力顯微鏡被廣泛應(yīng)用于DNA力譜的測量。圖13給出了一張典型的拉伸DNA的力譜譜圖［64］。此譜圖有兩個明顯的特征:其一為65 pN附近寬的平臺，對應(yīng)于B型DNA從完全伸展到被進(jìn)一步拉伸的狀態(tài);其二為150 pN附近的平臺，對應(yīng)于雙鏈DNA解離為單鏈DNA。通過力譜可以進(jìn)一步研究藥物分子對DNA力學(xué)性能的影響，同時通過力譜也可獲得藥物分子－DNA相互作用的信息［64，65］。Lindsay研究小組最近通過力譜測量了DNA堿基對氫鍵的壽命［66］。出人意料的是，A－T和AA－T堿基對的壽命分別長達(dá)2秒和4秒之久。這意味著在原子力顯微鏡測量時，堿基間對氫鍵的打開方式有可能與傳統(tǒng)測量中的打開方式截然不同。

圖13 DNA力譜及對應(yīng)的DNA構(gòu)象變化示意圖［64］

2.2 核糖核酸(RNA)

2.2.1 成像

盡管原子力顯微鏡發(fā)明數(shù)年后就被用于RNA成像［67，68］，而且 RNA 分子在生物學(xué)等領(lǐng)域有著十分重要的地位，但用原子力顯微鏡研究RNA的論文數(shù)僅為DNA的14%(SCI topic檢索“afmanddna”得3397篇文章，檢索“afm and rna”得461篇文章;截止2012年7月19日)。這可能和RNA穩(wěn)定性較差、易被降解有關(guān)。這也為該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供了機(jī)遇。

Lindsay研究小組早期利用修飾的云母，成功地得到了雙鏈RNA的原子力顯微鏡圖像，并獲得了和電子顯微鏡相近的長度和寬度數(shù)據(jù)［67，68］。和DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)相比較，生理條件下RNA分子一般會形成三維結(jié)構(gòu)。圖14給出了從STMV新鮮抽提的RNA的原子力顯微鏡圖像，可以看出RNA緊密卷曲成球狀［69］。加熱后由球狀展為線性，冷卻后又恢復(fù)成球狀。

圖14 從STMV病毒新鮮抽提出的RNA(a－b)及其受熱分解(c－f)的原子力顯微鏡圖像［69］

Chworos等人利用鎂離子介導(dǎo)的發(fā)卡狀RNA“環(huán)環(huán)相互作用”(loop－loopinteraction)設(shè)計了正方形結(jié)構(gòu)的tectosquare構(gòu)筑單元，然后用此構(gòu)筑單元進(jìn)一步組裝各類納米尺度的圖案(圖15)［70］。因為鎂離子起著穩(wěn)定納米圖案的作用，因此樣品制備和成像時均添加了適合濃度的鎂離子。研究人員還利用pRNA(一種源自噬菌體phi29病毒的包裝RNA)“環(huán)環(huán)相互作用”組裝了二聚體、三聚體、四聚體以及六聚體等納米結(jié)構(gòu)［71，72］。如在 pRNA中引入各類治療的分子(比如小干擾RNA、適配體等)，則能進(jìn)一步得到具有治療作用的RNA納米顆粒。

圖15 以tectosquare為構(gòu)筑單元組裝各類納米圖案的示意圖及原子力顯微鏡圖像［70］

2.2.2 力譜

與雙鏈DNA的力譜類似，雙鏈RNA的力譜也有從準(zhǔn)A型構(gòu)象到拉伸構(gòu)象的變化，而且需要的拉力也和G－C堿基對的含量有關(guān)［71］。與之不同的是，拉伸雙鏈RNA所需要的力更大，而且S－因子也更大(雙鏈DNA的S－因子約為0.7，RNA的S－因子約為1.0)。單鏈RNA的力譜則截然不同。因為單鏈RNA一般包含多個發(fā)卡狀的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有明確的溶解溫度，因而其力譜也不存在明顯的構(gòu)象變化。另外，單鏈RNA可以有許多不同的構(gòu)象，且不同構(gòu)象之間的差異十分微小，因而每次測量時會得到不同的力譜。最近，Liu等人利用力譜研究了煙草花葉病毒中RNA從其蛋白質(zhì)外殼上解離和組裝過程(圖16)［72］。結(jié)果表明，將RNA從其蛋白質(zhì)外殼剝離的力隨著拉伸速率的增加而增大。同時，在適合條件下，解離的RNA還能組裝回蛋白質(zhì)外殼上。

圖16 利用力譜研究煙草花葉病毒中RNA從其蛋白質(zhì)外殼上解離和組裝［72］

3 蛋白質(zhì)

3.1 成像

原子力顯微鏡在蛋白質(zhì)成像也取得了長足進(jìn)展［73］。圖17給出了紫膜及其細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的高分辨原子力顯微鏡圖像。可以清楚地看到細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白以三聚體緊密組裝在紫膜上［73］。最近，研究人員利用高速原子力顯微鏡實(shí)時觀測肌球蛋白V變體 M5－HMM在肌動蛋白軌道上行走(圖18)［74］。當(dāng)原子力顯微鏡以 146.7 毫秒/幀的高速成像是，便能清楚地實(shí)時捕獲該行走過程。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)M5－HMM以大約36 nm/步的長度行走。這不僅直接驗證了以前肌球蛋白V運(yùn)動的模型，而且加深了人們對生物馬達(dá)運(yùn)作機(jī)理的理解。

圖17 紫膜及其細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的原子力顯微鏡圖像［73］

圖18 利用高速原子力顯微鏡實(shí)時觀測肌球蛋白V變體M5－HMM在肌動蛋白軌道上行走［74］

3.2 力譜

力譜可以研究蛋白質(zhì)的力學(xué)性能。早期實(shí)驗中，人們通過拉伸免疫球蛋白分子研究了其去折疊過程的力學(xué)行為［75］。結(jié)果表明拉伸單個亞基需要150到300 pN的力。同時發(fā)現(xiàn)，在一定情況下被拉伸的蛋白質(zhì)能重新折疊。用力譜還可以研究蛋白質(zhì)與其他分子(比如藥物分子、DNA、其他蛋白質(zhì)等)的相互作用。近年來，Becker等人利用力譜研究了蜘蛛絲的力學(xué)性能(圖19)［76］。研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛絲的力譜有明顯的鋸齒形波動，符合自修復(fù)生物材料的力學(xué)特性。

圖19 利用原子力顯微鏡力譜研究蜘蛛絲的力學(xué)性能［76］

4 其他生物分子

下面將簡要介紹一下原子力顯微鏡在研究其他生物分子中的應(yīng)用。

4.1 磷脂

多數(shù)情況下，磷脂膜被修飾在基底上作為支撐來研究蛋白質(zhì)等其他生物分子的性質(zhì)(如前面所舉紫膜中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的例子)。也可以用原子力顯微鏡來研究磷脂膜自身的性質(zhì)，比如其成膜動力學(xué)或者與藥物分子相互作用等。Berquand等人用原子力顯微鏡實(shí)時成像技術(shù)研究了抗生素阿奇霉素對幾類磷脂膜的影響(圖20)［77］。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、鞘磷脂(SM)、鞘磷脂－膽固醇(SM－Chl)分別與二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)混合時，會發(fā)生相分離，形成各自的微區(qū)。當(dāng)加入1 mM的阿奇霉素時，DPPC微區(qū)會在一小時內(nèi)逐漸消失，而其余兩類微區(qū)結(jié)構(gòu)則不受影響。此研究結(jié)果表明藥物分子對磷脂酶的影響與其自身的性質(zhì)緊密相關(guān)，為進(jìn)一步研究磷脂膜的生物物理及藥理提供了幫助。

圖20 利用原子力顯微鏡實(shí)時研究磷脂膜與藥物分子相互作用［77］

4.2 多糖

和其他技術(shù)相比較，原子力顯微鏡不僅可以觀察單個多糖分子的形貌，而且能夠研究其聚集體的形貌和不均勻性(heterogeneity)。早期實(shí)驗中，人們已經(jīng)研究了許多多糖，比如纖維素、淀粉等。Funami等人最近利用原子力顯微鏡成像技術(shù)較系統(tǒng)地研究了食物多糖［78］。圖21給出了一個結(jié)冷膠(Gellan Gum)的例子，發(fā)現(xiàn)和去?；Y(jié)冷膠相比較，?；Y(jié)冷膠的更易彎曲。在鉀離子存在時，還能觀測到去?；Y(jié)冷膠的平行雙鏈結(jié)構(gòu)。

圖21 利用原子力顯微鏡研究多糖的形貌［78］

通過力譜，可以研究伴隨多糖構(gòu)象變化的力學(xué)性質(zhì)。早期，人們研究了直鏈淀粉和葡聚糖的力譜，結(jié)合計算可以推斷拉伸從椅式到船式構(gòu)象變化所需要力的大?。?］。近來，此方面研究拓展到了活體中多糖力譜的測量。Francius等人研究了益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosusGG)表面多糖的分布及其力學(xué)性質(zhì)［79］。通過配體修飾的針尖，可以定位和測量富含甘露糖多糖及富含半乳糖多糖的分布和拉伸性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)后者能被拉伸更長。而且和野生型相比較，突變體表面多糖的分布較為疏松，且長度更短(圖22)。

圖22 利用原子力顯微鏡研究細(xì)菌表面多糖的分布及其力學(xué)性質(zhì)［79］

4.3 細(xì)胞/細(xì)菌

如前所述，原子力顯微鏡可以用來研究細(xì)胞/細(xì)菌表面多糖的分布及其力學(xué)性質(zhì)［79］。此外，也被用于研究細(xì)胞/細(xì)菌表面其他生物分子(比如蛋白質(zhì)等)的相關(guān)性質(zhì)［8］。實(shí)際上，在原子力顯微鏡發(fā)展的初期，就已經(jīng)被用于細(xì)胞的成像研究［3］。Iyer等人近來將原子力顯微鏡應(yīng)用于癌細(xì)胞研究［80］。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，和正常細(xì)胞表面的單一觸角層(brushlayer)相比較，癌細(xì)胞表面則主要是長度不同的兩觸角層(brushlayer)(圖23)。

圖23 利用原子力顯微鏡比較研究正常細(xì)胞和癌細(xì)胞［80］

Raman等人最近發(fā)展了一種利用原子力顯微鏡測量活體細(xì)胞機(jī)械性能的新方法［81］。使用這種方法，他們研究了三種不同細(xì)胞(即大腸桿菌、老鼠成纖維細(xì)胞和人類紅血細(xì)胞)的局部細(xì)胞剛度、剛度梯度、粘彈性耗散等機(jī)械性質(zhì)(圖24)。該方法具有普適性，且適用于商品化的原子力顯微鏡，有望進(jìn)一步推廣研究細(xì)胞的黏著、運(yùn)動、形變等行為。

圖24 利用原子力顯微鏡研究人類紅血細(xì)胞［81］

4.4 病毒

Kuznetsov等然早期利用原子力顯微鏡成像技術(shù)研究了幾類病毒的尺寸和形貌，發(fā)現(xiàn)可以通過這些參數(shù)區(qū)分不同的病毒82。相對于電子顯微鏡或者X－射線衍射技術(shù)，原子力顯微鏡目前還不能提供病毒更精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。在其后續(xù)的工作中，他們進(jìn)一步研究了從病毒抽提出的RNA的性質(zhì)(參見 3.2.1 部分)［69］。Balci等人利用疏水作用將檸檬酸鈉保護(hù)的金納米顆粒選擇性地組裝在煙草花葉病毒的兩端83。通過無電沉積，可以進(jìn)一步生長得啞鈴狀的納米組裝體(圖25)。

圖25 利用原子力顯微鏡研究金納米顆粒在煙草花葉病毒上的組裝行為［83］

5 小結(jié)與展望

本文簡要總結(jié)了原子力顯微鏡成像和力譜技術(shù)及其在生物研究中的應(yīng)用，展示了此技術(shù)在生物研究領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。雖然被稱作是“原子”力顯微鏡，但目前的絕大多數(shù)研究還達(dá)不到此水平，因此原子級分辨率的成像會是將來發(fā)展的一個重要方向［84］。當(dāng)前，隨著一些新的技術(shù)方法和設(shè)計的引入(如高速掃描(high－speed)和動態(tài)(dynamic)技術(shù))，研究人員已經(jīng)可以跟蹤一些活體的生化反應(yīng)。但這些技術(shù)還局限在極少數(shù)的幾個實(shí)驗室，目前亟需進(jìn)一步推廣普及這類技術(shù)并拓寬其應(yīng)用范圍。另外，如能和其它技術(shù)有機(jī)結(jié)合(比如AFM－Raman聯(lián)用)，將發(fā)展能對復(fù)雜生物體系進(jìn)行綜合表征的方法平臺。該方法已經(jīng)在DNA測序方面顯示了很好的潛力［85］，目前最大的挑戰(zhàn)是如何優(yōu)化方法使其滿足商業(yè)化測序的要求。在DNA操縱方面，最近也報道了一些很有意思的工作［86］，將這些研究工作進(jìn)一步拓展，則能對生物芯片制備及生物納米操縱領(lǐng)域起到很好的幫助作用。

致謝:感謝國家自然科學(xué)基金及國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973)項目的支持。

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