魏立雯， 袁章琴， 趙明德， 韓建紅， 古從偉， 付陸*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四川瀘州646000； 2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科研究所，江蘇蘇州215006)

隨著人類生活水平的提高，肥胖已成為全球性的現(xiàn)代文明病，它是目前發(fā)病率急劇上升的一種慢性疾病(王瑾等，2016)。肥胖常伴隨多種嚴(yán)重并發(fā)癥，涉及心血管、神經(jīng)、呼吸、內(nèi)分泌和消化等多個(gè)系統(tǒng)(湯劐菱等，2007)。因此，世界衛(wèi)生組織已確認(rèn)肥胖為一種疾病，并向全世界宣布“肥胖癥將是全球首要的健康問題”。深入了解脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制，對于改善人體健康、靶向調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂及其誘發(fā)的其他代謝性疾病，具有非常重要的意義。

大麻素受體(cannabinoid receptor 1，CB1)是內(nèi)源性大麻素(endogenous cannabinoid，EC)信號系統(tǒng)的主要受體(胡予等，2007)，在脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗及葡萄糖攝取等機(jī)制中發(fā)揮重要作用，與糖尿病、肥胖以及脂肪沉積密切相關(guān)(Howlettetal.，2002；Matiasetal.，2006)。利莫那班(SR141716)是CB1受體抑制劑，通過選擇性阻斷EC信號系統(tǒng)中CB1發(fā)揮作用(馬微等，2010)。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1，CPT1)是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶，與脂肪酸分解和體脂含量密切相關(guān)(Louetetal.，2001)。CPT1高表達(dá)可以促進(jìn)脂肪酸分解、降低體脂百分比、改善肝臟變性(Mussoetal.，2009)。其中，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(CPT1A)主要在肝臟、腎臟和胰腺表達(dá)，主要作用是調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化、促進(jìn)脂肪生成，其表達(dá)量降低會導(dǎo)致線粒體功能障礙、脂肪肝和肥胖(Drynanetal.，1996；Amengualetal.，2012)。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1B(CPT1B)主要在心臟和脂肪組織表達(dá)，低表達(dá)時(shí)引起心臟功能障礙、白色脂肪組織的脂肪沉積(Heetal.，2012；Ratneretal.，2015)。

本課題組前期的研究表明，在體外細(xì)胞中，CB1通過調(diào)控CPT1A和CPT1B的表達(dá)影響脂質(zhì)代謝和脂肪沉積(Zhangetal.，2014)。但是，目前還沒有實(shí)驗(yàn)研究體內(nèi)CB1通過對CPT1A、CPT1B作用來調(diào)節(jié)肥胖和脂質(zhì)代謝的作用。本研究使用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠構(gòu)建肥胖模型，給予SR141716觀察CB1對CPT1A、CPT1B表達(dá)的影響，為臨床上預(yù)防代謝紊亂提供新思路。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建肥胖模型

選取70只5周齡健康雄性C57BL/6J小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030。飼喂于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(川)2013-065，溫度20～24 ℃，濕度40%～70%，光照時(shí)間為08∶00—20∶00。其中,20只給予正常標(biāo)準(zhǔn)飼料，另外50只給予高脂飼料，共16周。收集血液測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。根據(jù)血清生化指標(biāo)篩選出30只肥胖模型小鼠。

1.2 藥物處理及采樣

將SR141716溶解在含0.1%Tween-80的蒸餾水中。從標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)組中隨機(jī)選取15只小鼠做空白對照(S-Veh組)，隨機(jī)將30只肥胖模型小鼠分為2組(D-Veh組、D-SR組)。S-Veh組和D-Veh組灌胃0.1%Tween-80，D-SR組灌胃SR141716(10 mg·kg-1·day-1)，每日測量小鼠體質(zhì)量，共3周。灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，采集血液，用于測定生化指標(biāo)。分離采集各組織樣本，生理鹽水沖洗后，稱量，待RNA和蛋白質(zhì)提取用。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測

運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀(ES-480)檢測血清中TG、TC、HDL和LDL的含量。使用Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，USA)，按照ELISA試劑盒(Boster，武漢)檢測血清脂聯(lián)素和瘦素含量。

1.4 總RNA提取和cDNA的制備

使用RNAsimple Total RNA Kit(TianGen，北京)提取試劑盒，按照說明提取各組織總RNA，并通過A260/A280值和1%瓊脂糖凝膠電泳判斷所提取的RNA質(zhì)量。使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用2-△△CT法(Vandesompeleetal.，2002)以β-actin和GAPDH作為雙內(nèi)參，在CFX96TMReal-time System上檢測CB1、CPT1A和CPT1B基因在各組織中mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)NCBI提供的各基因參考序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，由北京六合華大基因有限公司合成。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)試劑盒的使用說明書加樣，標(biāo)準(zhǔn)品作為板間對照，并設(shè)No-Template Control，每個(gè)待測樣3個(gè)重復(fù)。

1.6 Western Blot檢測CB1的表達(dá)量

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液(Pierce Biotechnology，USA)提取各組織蛋白質(zhì)。利用BCA Protein Assay Kit(Life Technologies，USA)測定蛋白質(zhì)含量。CB1單克隆抗體(Beverly，USA)、β-actin(Santa，USA)以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Boster，武漢)。Western Blot實(shí)驗(yàn)的具體操作方法主要參考Fu等(2016)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 The primers used for qPCR

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以Mean±SE表示，運(yùn)用SPSS 19.0分析處理，組間的差異比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血清生化指標(biāo)的變化

在藥物處理之前，S-Veh、D-Veh和D-SR各組小鼠的平均體質(zhì)量分別為30.5 g±0.4 g、40.6 g±0.3 g和41.2 g±0.4 g，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)S-Veh組與D-Veh組、D-SR組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而D-Veh組和D-SR組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過3周SR141716灌胃處理后，各組小鼠的平均體質(zhì)量分別為28.4 g±0.5 g、36.5 g±0.8 g和30.3 g±1.2 g。與D-Veh組相比，D-SR組小鼠的體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)；與D-Veh組相比，D-SR組小鼠的肝臟質(zhì)量顯著降低(P<0.05)(圖1)。同時(shí)，血清生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，與D-Veh組相比，D-SR組的TC和瘦素含量顯著降低(P<0.05)，HDL和脂聯(lián)素含量顯著升高(P<0.05)，而TG和LDL含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

圖1 小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量的變化Fig. 1 The change of body mass and liver mass of mice

組別Group甘油三酯TG/(mg·dL-1)總膽固醇TC/(mg·dL-1)高密度脂蛋白HDL/(mg·dL-1)低密度脂蛋白LDL/(mg·dL-1)脂聯(lián)素Adiponectin/(μg·mL-1)瘦素Leptin/(ng·mL-1)S-Veh256.3±12.881.2±4.848.1±1.523.6±0.720.3±0.96.71±0.48D-Veh168.3±8.9135.4±9.537.2±0.824.8±1.916.7±1.227.43±0.95D-SR175.2±11.6121.7±7.1*55.7±1.9**26.1±1.322.5±1.4*15.62±1.23**

注： D-Veh組和D-SR組相比，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Notes： Comparison between D-Veh and D-SR，*P<0.05，**P<0.01； the same below

2.2 SR141716高效抑制CB1的表達(dá)水平

qPCR結(jié)果表明(圖2：a)，與D-Veh組相比，在D-SR組小鼠的皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、骨骼肌和肝臟組織中，SR141716分別抑制了CB1基因mRNA表達(dá)水平的85.1%、87.8%、72.6%和91.3%(P<0.01)。同時(shí)，CB1基因mRNA表達(dá)水平在S-Veh組和D-Veh組小鼠各組織間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western Blot結(jié)果表明(圖2：b)，CB1蛋白質(zhì)表達(dá)量在D-SR組小鼠的皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、骨骼肌、肝臟、心臟等組織中明顯降低(P<0.05)。

2.3 CB1顯著上調(diào)CPT1A、CPT1B基因的mRNA表達(dá)水平

與D-Veh組相比，CPT1A的表達(dá)量在D-SR組小鼠的肝臟中顯著上調(diào)(P<0.05)，CPT1B的表達(dá)量在D-SR組小鼠的皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、骨骼肌組織中顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3)。

圖2 小鼠組織中CB1的mRNA(a)和蛋白質(zhì)(b)表達(dá)水平Fig. 2 The mRNA (a) and protein (b) levels of CB1 in mice

圖3 小鼠組織中CPT1A和CPT1B的mRNA表達(dá)水平Fig. 3 The mRNA levels of CPT1A and CPT1B in mice

3 討論

CB1是脂質(zhì)類EC信號系統(tǒng)的主要受體，在脂肪代謝平衡、腦發(fā)育、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及食欲控制等機(jī)制中發(fā)揮著重要作用(Matiasetal.，2006；Katona & Freund，2012；Lutzetal.，2015；Lu & Mackie，2016)。SR141716作為CB1受體抑制劑已被商品化為食欲抑制劑、減肥藥物(Rinaldi-Carmonaetal.，1994)。Leite等(2009)研究證實(shí)SR141716能夠促進(jìn)脂類分解，降低體質(zhì)量，也可以通過降低TG、游離脂肪酸和TC，增高HDL/LDL比值改善血脂異常狀況。

本研究旨在觀察CB1對脂質(zhì)代謝、體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血清中TG、TC、HDL、LDL、脂聯(lián)素和瘦素含量的影響。結(jié)果表明，SR141716灌胃組小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血清中TC和瘦素含量顯著降低，血清中HDL和脂聯(lián)素含量增加，然而，血清中TG和LDL含量沒有明顯改變。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與CB1可以降低體質(zhì)量、減小腹圍、改善肝脂肪變性及血脂異常狀況的結(jié)論(Tangetal.，2012)基本一致。

大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，外周組織中CB1有望成為治療肥胖和代謝綜合征的新靶點(diǎn)(Crespilloetal.，2010；Silvestrietal.，2011)。前期體外實(shí)驗(yàn)證明，SR141716降低了CB1 mRNA水平的表達(dá)，但是增加了CPT1A和CPT1B的表達(dá)，從而減少了脂肪沉積(Zhangetal.，2014)。研究結(jié)果顯示，肥胖模型小鼠皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、骨骼肌和肝臟組織中CB1在mRNA和蛋白質(zhì)水平均呈現(xiàn)高表達(dá)。SR141716灌胃處理后，CB1的表達(dá)顯著下降，而CPT1A、CPT1B的表達(dá)隨之升高。CPT1A的高表達(dá)主要在肝臟，而在骨骼肌、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪組織中低表達(dá)。與CPT1A相反，CPT1B高表達(dá)在骨骼肌、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪組織，低表達(dá)在肝臟。Nogueiras等(2008)的結(jié)果也證實(shí)，CB1受抑制后上調(diào)CPT1，從而促進(jìn)脂肪分解、抑制脂肪生成。值得一提的是，低水平的CB1可在心臟中檢測到，然而本實(shí)驗(yàn)中CPT1A和CPT1B在心臟的表達(dá)水平非常低，與前期在豬和心肌細(xì)胞上的研究結(jié)果相反(Zhangetal.，2014)。因此，關(guān)于CPT1A和CPT1B在心臟中的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)論證實(shí)CB1通過作用于CPT1A、CPT1B發(fā)揮對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用，提高血清中TC、HDL、脂聯(lián)素和瘦素含量，為靶向調(diào)控脂質(zhì)代謝提供了可靠的依據(jù)。

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