吳傳松 史裕英 傅繼歡 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心 （北京 100044）

內(nèi)容提要： 近日，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）聯(lián)合發(fā)表關(guān)于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測(cè)相關(guān)的研究進(jìn)展，主要針對(duì)實(shí)體瘤中ctDNA變異以及DNA序列或拷貝數(shù)情況，從樣本前處理過(guò)程、分析性能研究、臨床評(píng)價(jià)以及結(jié)果解讀幾個(gè)方面進(jìn)行了分析。對(duì)未來(lái)的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）相關(guān)研究提供了框架性建議，旨在更好地指引和規(guī)范ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。文章通過(guò)對(duì)循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測(cè)研究進(jìn)展分析總結(jié)，希望對(duì)我國(guó)循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）相關(guān)產(chǎn)品研制起到借鑒意義。

液體活檢技術(shù)主要是對(duì)血液等體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（Circulating Tumor DNA，ctDNA）以及外泌體等進(jìn)行的診斷分析技術(shù)，具有便捷、微創(chuàng)、便于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、更容易整體反應(yīng)患者腫瘤基因信息等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在腫瘤診療領(lǐng)域備受關(guān)注，ctDNA檢測(cè)已成為業(yè)界的研究熱點(diǎn)[1]。用于ctDNA檢測(cè)的方法主要包括基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)（如ARMS-PCR、數(shù)字PCR、BEAMing）和基于二代測(cè)序技術(shù)（NGS）。其中，基于PCR技術(shù)的ctDNA檢測(cè)適用于檢測(cè)單個(gè)或少量的特定的突變體，而基于NGS技術(shù)的檢測(cè)通常設(shè)計(jì)覆蓋不同腫瘤類別、多種基因、更大數(shù)量的突變類型[2]。

鑒于臨床上越來(lái)越多的對(duì)循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）的基因變異進(jìn)行的分析評(píng)估，美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）和美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)（CAP）聯(lián)合評(píng)審總結(jié)了當(dāng)前臨床應(yīng)用ctDNA檢測(cè)的相關(guān)信息，并為未來(lái)的研究提供了框架性意見。專家組對(duì)實(shí)體瘤ctDNA檢測(cè)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行了回顧分析，包括考量分析前變量、分析有效性、解釋和報(bào)告、臨床有效性和實(shí)用性。通過(guò)文獻(xiàn)檢索搜索了1338份參考文獻(xiàn)，其中390份以及專家小組提供的31份參考文獻(xiàn)被選中進(jìn)行了全文評(píng)審，最終選中77篇文章匯總[3]。證據(jù)表明，ctDNA檢測(cè)最好是采用含細(xì)胞穩(wěn)定劑或EDTA管中收集的血漿樣本，同時(shí)EDTA管應(yīng)在采樣后6h內(nèi)進(jìn)行處理。雖然一些ctDNA檢測(cè)的臨床有效性和實(shí)用性已在某些晚期癌種上得到證實(shí)，但絕大多數(shù)ctDNA檢測(cè)缺乏足夠證據(jù)支持其在晚期癌癥中的臨床有效性及實(shí)用性。證據(jù)還顯示，ctDNA檢測(cè)結(jié)果與腫瘤標(biāo)本的基因分型結(jié)果并不完全一致，建議對(duì)腫瘤組織進(jìn)行基因分型以確認(rèn)在ctDNA未檢出的結(jié)果。目前，ctDNA檢測(cè)在早期癌癥、治療監(jiān)測(cè)或殘留腫瘤檢測(cè)中應(yīng)用的臨床有效性證據(jù)非常有限，也缺乏相關(guān)的臨床實(shí)用性證據(jù)。除臨床試驗(yàn)外，無(wú)證據(jù)表明ctDNA檢測(cè)對(duì)癌癥篩查是有用的。鑒于ctDNA研究以及臨床工具和指南的迅速發(fā)展，很快就需要再次評(píng)價(jià)相關(guān)文獻(xiàn)。

1.樣本前處理相關(guān)變量

在ctDNA檢測(cè)樣本前處理步驟中存在眾多不確定因素，而這些變量可能會(huì)影響樣本質(zhì)量、DNA的提取等，從而影響后續(xù)的檢測(cè)評(píng)價(jià)。

目前，研究表明最佳的樣本類型是血漿，且最好采用含細(xì)胞穩(wěn)定劑的抗凝管或EDTA抗凝管采集血液。采用EDTA抗凝管時(shí)，應(yīng)在采樣后6h內(nèi)盡快處理，分離血漿。該過(guò)程中應(yīng)盡可能降低白細(xì)胞溶解產(chǎn)生的大量細(xì)胞游離DNA對(duì)ctDNA的稀釋影響。

整體而言，在樣本抽血、采集、處理、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、DNA提取純化等步驟中存在諸多可能影響后續(xù)檢測(cè)的因素。此外，患者相關(guān)的生物學(xué)因素也可能會(huì)影響患者血液中游離DNA的釋放，如吸煙、貧血、炎癥類非惡性疾病、自身免疫性疾病等。而目前這方面的研究還很有限，諸多問(wèn)題尚待解決。

2.分析性能研究

分析有效性指能準(zhǔn)確、可靠地檢出突變的能力，包括準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、重復(fù)性等。目前，評(píng)價(jià)血漿ctDNA檢測(cè)準(zhǔn)確性和特異性的方法主要是通過(guò)與配對(duì)組織樣本檢測(cè)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)。研究表明，血漿ctDNA檢測(cè)與組織檢測(cè)存在不一致情況，該情況除了受到分析性能（如分析靈敏度）的影響，也可能是其他生物學(xué)因素引起的，如癌癥類別、腫瘤分期、腫瘤空間和時(shí)間的異質(zhì)性、組織血漿取樣時(shí)間差等。

由于血漿中ctDNA含量較低，對(duì)于檢測(cè)下限的研究很重要，考慮到上述生物學(xué)因素可能的影響，建議納入細(xì)胞系或人工構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化的樣本，對(duì)檢測(cè)限附近的檢出能力進(jìn)行研究驗(yàn)證。目前，不同突變類型的最佳檢測(cè)下限還未進(jìn)行系統(tǒng)性研究，該檢測(cè)限也可能將根據(jù)預(yù)期用途而變化。

此外，當(dāng)前不同的ctDNA檢測(cè)能力存在差別，未來(lái)的研究應(yīng)考慮進(jìn)行更多大型的跨平臺(tái)比對(duì)研究。同時(shí)，下一步應(yīng)綜合考慮樣本前處理和分析檢測(cè)中的變量開展研究，確保檢測(cè)質(zhì)量。最后，建議應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途研究建立ctDNA檢測(cè)最低的分析靈敏度和特異性，以促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

3.結(jié)果解讀和報(bào)告

ctDNA檢測(cè)結(jié)果的解讀面臨著一些特有的挑戰(zhàn)，尤其應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

第一，治療方案的選擇是多種因素指導(dǎo)下的精細(xì)過(guò)程，包括腫瘤類別、等級(jí)、分期、患者身體狀況、前期治療方案以及遺傳發(fā)現(xiàn)。根據(jù)原發(fā)腫瘤位置，相同的突變體可能有不同的治療方案。當(dāng)ctDNA報(bào)告顯示對(duì)某一特定基因突變可以采取治療措施時(shí)，需要加強(qiáng)注意。建議對(duì)潛在可采取措施的討論限制為突變體與已建立臨床有效性的治療選擇間的整體相關(guān)性，以避免對(duì)患者特定的治療推薦，同時(shí)強(qiáng)調(diào)突變結(jié)果必須結(jié)合其他的臨床診療信息來(lái)確定治療方案。在可檢測(cè)胚系突變的應(yīng)用中，注意對(duì)于模棱兩可的結(jié)果，或可能是胚系突變的結(jié)果進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)和解讀。

第二，不同患者的ctDNA占血漿中總游離DNA的比例（也可稱為純度）存在較大差異，ctDNA檢測(cè)的等位基因突變比率需要謹(jǐn)慎解讀。不同分析前處理過(guò)程得到的樣本中白細(xì)胞DNA相對(duì)含量也不盡相同。對(duì)意義不明的克隆性造血情形中的基因突變應(yīng)謹(jǐn)慎解讀。

第三，不同患者中ctDNA占總細(xì)胞游離DNA的比例差異較大，不同樣本前處理過(guò)程得到的樣本中白細(xì)胞釋放的游離DNA也不盡相同，需要進(jìn)一步研究ctDNA檢測(cè)的基因突變豐度的預(yù)后意義。

第四，ctDNA檢測(cè)結(jié)果可能與組織檢測(cè)結(jié)果不一致，考慮到釋放在血漿中的ctDNA含量通常較低，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥中血腦屏障的影響可能較大，因此對(duì)于未檢出結(jié)果要進(jìn)行謹(jǐn)慎解讀和說(shuō)明。

4.臨床性能評(píng)價(jià)

一旦腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)展現(xiàn)出準(zhǔn)確的分析有效性，下一步就需要證明其臨床有效性，更重要的是臨床實(shí)用性。這些是醫(yī)生和患者采用該檢測(cè)做出治療決策的基本因素。如果一個(gè)ctDNA檢測(cè)的臨床有效性未證實(shí)前，其具有臨床實(shí)用性是不太可能的，但反過(guò)來(lái)并不成立。一個(gè)檢測(cè)可能有臨床有效性，但無(wú)臨床實(shí)用性，證明臨床有效性不能說(shuō)明或暗示其也具有臨床實(shí)用性。建立臨床實(shí)用性的幾種方法已經(jīng)被提出，可通過(guò)前瞻性的臨床試驗(yàn)或?qū)χ暗那罢靶耘R床試驗(yàn)中可獲得的樣本進(jìn)行回顧性的表征。對(duì)于ctDNA檢測(cè)，除非在樣本收集、處理和儲(chǔ)存過(guò)程中非常小心，否則之前提到的分析前問(wèn)題將會(huì)導(dǎo)致后續(xù)檢測(cè)的不確定性。

ctDNA檢測(cè)可能被用于多個(gè)方面。此處，主要關(guān)注ctDNA檢測(cè)在轉(zhuǎn)移性癌癥中的應(yīng)用，ctDNA檢測(cè)在其他方面的應(yīng)用還缺乏相關(guān)顯著證據(jù)。

文章根據(jù)ctDNA檢測(cè)不同的預(yù)期用途，從以下幾個(gè)方面展開，主要關(guān)注了在轉(zhuǎn)移性癌癥中的應(yīng)用。

4.1 應(yīng)用于晚期癌癥中的治療方案選擇

ctDNA檢測(cè)在該方面應(yīng)用的研究相對(duì)較多，目前也有獲批的基于PCR技術(shù)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者中的EGFR突變狀態(tài)的產(chǎn)品。其臨床實(shí)用性主要是通過(guò)對(duì)之前的臨床試驗(yàn)中獲得的樣本進(jìn)行回顧性檢測(cè)分析得到的。其中，需要特別注意的是，由于存在部分假陰性結(jié)果，尤其是在T790檢測(cè)情形中，對(duì)未檢出的結(jié)果應(yīng)盡可能通過(guò)后續(xù)的組織檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。

目前有兩種途徑展示ctDNA檢測(cè)的臨床實(shí)用性以將其作為臨床有效的檢測(cè)方法。最可信的方法是開展前瞻性的臨床研究來(lái)考察ctDNA臨床實(shí)用性。到目前，還未有此類的臨床試驗(yàn)報(bào)道。第二種策略是評(píng)價(jià)是否ctDNA檢測(cè)可以提供和組織檢測(cè)相同的信息。如果組織檢測(cè)已經(jīng)有明顯的證據(jù)證實(shí)臨床實(shí)用性，ctDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二者間高的一致性或許可以表明ctDNA檢測(cè)在指導(dǎo)患者治療決策方面的臨床實(shí)用性。

此外，由于晚期癌癥中存在腫瘤異質(zhì)性，ctDNA可能是來(lái)自所有的轉(zhuǎn)移部位，而組織檢測(cè)通常是在單一轉(zhuǎn)移部位或原發(fā)病灶處進(jìn)行的。高靈敏度的ctDNA檢測(cè)可能檢測(cè)到亞克隆突變，在不同情形中，亞克隆突變可能的影響還值得進(jìn)一步研究[4]。

整體而言，除了已獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)的檢測(cè)外，大多數(shù)檢測(cè)方法還沒(méi)有充分證據(jù)表明其臨床有效性，并且大都不具有臨床實(shí)用性證據(jù)，接下來(lái)的研究應(yīng)盡可能納入與預(yù)期人群接近的患者，同時(shí)樣本要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)控，開展前瞻性的臨床研究充分驗(yàn)證其臨床意義。

4.2 應(yīng)用于療效監(jiān)測(cè)

ctDNA檢測(cè)應(yīng)用于療效監(jiān)測(cè)時(shí)，主要是定量檢測(cè)ctDNA隨時(shí)間變化的情況。然而在該過(guò)程還存在諸多挑戰(zhàn)，包括考慮樣本前處理和分析過(guò)程的有效性和可重復(fù)性的影響，需要研究驗(yàn)證不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果間的可互換性問(wèn)題，建立量化DNA負(fù)荷的最佳單位等。

ctDNA水平變化與腫瘤響應(yīng)或反饋之間的關(guān)系已經(jīng)在少量研究中建立，包括了多種腫瘤類別，例如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌和黑色素瘤。此外，研究表明，與標(biāo)準(zhǔn)放射檢測(cè)相比，ctDNA分析可以提前數(shù)月檢測(cè)到耐藥突變，為在疾病進(jìn)展之前調(diào)整治療方案提供了可能。

然而，由于缺乏ctDNA的監(jiān)測(cè)應(yīng)用方面的大規(guī)模前瞻性驗(yàn)證試驗(yàn)，臨床有效性的可靠證據(jù)不足，更不用說(shuō)臨床實(shí)用性。已發(fā)表的研究大多數(shù)是回顧性的，且很少有與已建立的響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行的嚴(yán)格比對(duì)試驗(yàn)。此外，與標(biāo)準(zhǔn)診療監(jiān)測(cè)方法相比，沒(méi)有研究證實(shí)該檢測(cè)可以提高患者的療效或費(fèi)用的減少。同時(shí)，沒(méi)有證據(jù)支持在臨床進(jìn)展之前根據(jù)ctDNA進(jìn)展結(jié)果來(lái)調(diào)整治療方案。最后，一些數(shù)據(jù)表明ctDNA檢測(cè)響應(yīng)存在與影像學(xué)檢測(cè)響應(yīng)不同步的情況，這或許會(huì)使ctDNA在監(jiān)測(cè)方面的有效性驗(yàn)證變得復(fù)雜，同時(shí)也暗示該類研究最終除了要評(píng)估與放射成像響應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)還需要評(píng)價(jià)臨床結(jié)果。

4.3 應(yīng)用于殘留病灶的檢測(cè)

ctDNA也有希望用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)經(jīng)治療后的殘留腫瘤狀況，可采用類似于目前臨床中對(duì)白血病管理的常規(guī)方式，即在初期治療后（或殘留疾病減輕后）檢測(cè)血液中白血病細(xì)胞。ctDNA可以在原發(fā)癌患者治療前被檢測(cè)到，然而與晚期癌癥相比，其ctDNA水平更低。結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌中的原理性研究表明，局部治療（手術(shù)或常規(guī)放療）后持續(xù)檢測(cè)ctDNA可以預(yù)測(cè)高危復(fù)發(fā)人群。在這些研究中，通常采用測(cè)序來(lái)檢測(cè)原發(fā)癌中體細(xì)胞突變情況，隨后將在血漿中檢測(cè)到的這些突變信息作為殘留腫瘤的證據(jù)。但目前仍缺乏證據(jù)證明ctDNA可以檢測(cè)到與最小殘留病檢測(cè)水平相近的低水平殘留腫瘤，即與白血病管理中的情況相似。

目前的研究大都是回顧性的，在前瞻性研究中還未有相關(guān)發(fā)現(xiàn)，因此該方面的臨床有效性證據(jù)是很有限的。沒(méi)有任何試驗(yàn)在ctDNA檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行了系統(tǒng)性地成像檢測(cè)以確認(rèn)在此時(shí)腫瘤還未發(fā)生明顯轉(zhuǎn)移。該應(yīng)用中，ctDNA檢測(cè)的假陰性率（ctDNA檢測(cè)陰性的患者發(fā)生復(fù)發(fā)）和假陽(yáng)性率（盡管ctDNA檢測(cè)陽(yáng)性，但沒(méi)有發(fā)生復(fù)發(fā)）還沒(méi)有被充分研究確定，需要進(jìn)行大規(guī)模前瞻性的研究來(lái)驗(yàn)證臨床有效性。

理論上講，用這種方法檢測(cè)殘留腫瘤的潛能在于根據(jù)ctDNA變化采取的早期治療可能根治疾病或者預(yù)防或延遲復(fù)發(fā)。該方面的臨床實(shí)用性還未明確，沒(méi)有證據(jù)表明在ctDNA檢測(cè)基礎(chǔ)上采取的治療提高了療效。實(shí)際上，循環(huán)腫瘤蛋白標(biāo)志物的前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)并未證明在乳腺癌和卵巢癌中對(duì)隱匿性復(fù)發(fā)的早期篩查可以帶來(lái)生存獲益，盡管有數(shù)據(jù)表明它們對(duì)結(jié)腸癌和前列腺癌是有幫助的。所以只能寄希望于未來(lái)的前瞻性隨機(jī)研究來(lái)驗(yàn)證其臨床實(shí)用性。

4.4 應(yīng)用于無(wú)癥狀人群的腫瘤篩查

考慮到可以在早期癌癥患者檢測(cè)到ctDNA，ctDNA在無(wú)癥狀人群中癌癥的早期檢測(cè)方面的應(yīng)用受到了關(guān)注。在對(duì)母體游離DNA進(jìn)行胎兒非整倍體檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的癌癥病例引發(fā)了該方面的應(yīng)用潛能。然而目前還沒(méi)有相關(guān)的臨床有效性和臨床實(shí)用性數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)性（包括技術(shù)和生物學(xué)因素）的程度也尚未明確，其中假陽(yáng)性情況包括健康人檢測(cè)到癌癥以及在判斷腫瘤組織的來(lái)源時(shí)。當(dāng)然也有可能在向轉(zhuǎn)變進(jìn)軍但無(wú)臨床意義的細(xì)胞中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA突變。這種生物學(xué)的假陽(yáng)性，也被稱為過(guò)度診斷，在乳腺癌的乳腺X射線攝影篩查和前列腺癌的前列腺特異性抗原篩查中有發(fā)生。但目前對(duì)于實(shí)體瘤領(lǐng)域，還缺乏相關(guān)有效的臨床有效性和臨床實(shí)用性證據(jù)，對(duì)于檢測(cè)假陽(yáng)性（包括檢測(cè)技術(shù)上和生物學(xué)因素）的程度也尚不明確。

5.總結(jié)

盡管ctDNA檢測(cè)在腫瘤診療領(lǐng)域顯示出諸多優(yōu)勢(shì)，但目前該技術(shù)在樣本前處理、分析性能、臨床有效性和臨床實(shí)用性方面還有諸多待研究的問(wèn)題，尤其在臨床有效性和臨床實(shí)用性證據(jù)方面，除了個(gè)別已批準(zhǔn)的產(chǎn)品在一定程度上表明了其臨床用途外，大多數(shù)用于癌癥篩查、治療方案選擇、療效監(jiān)測(cè)、殘留病灶檢測(cè)領(lǐng)域的檢測(cè)都缺乏有力的臨床證據(jù)，現(xiàn)階段不宜在臨床廣泛開展，接下來(lái)的研究中應(yīng)盡可能納入所有可能的預(yù)期人群類型，通過(guò)嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床研究來(lái)充分驗(yàn)證其臨床意義。