羅其勇，謝小軍

(1.廣西科技大學，廣西柳州 545006；2.西南大學生命科學學院， 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，水生生物及水環(huán)境研究所，重慶 400715)

水體中重金屬污染情況越來越受到人們關注，其主要源自人類活動過程中所產生的金屬和金屬類似物，通常具有毒性強、難降解、易于在生物體富集等特點。水產養(yǎng)殖業(yè)經過多年發(fā)展，因集約化養(yǎng)殖、高投入、高污染等不當措施帶來的養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，造成水產生物的病害頻發(fā)。而作為養(yǎng)殖環(huán)境中重要的環(huán)境條件之一，重金屬污染在局部區(qū)域呈現加重趨勢。因此，了解水體中重金屬暴露對魚類機體毒性作用，對于指導魚類養(yǎng)殖具有重要的現實意義。

重金屬離子進入魚類組織后會誘導活性氧物質(ROS)的產生，降低機體應對ROS氧化脅迫能力，造成機體氧化損傷[1-2]。機體應對ROS引起的氧化脅迫作用，會誘導抗氧化物質以清除ROS，其中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)等，是機體應對氧化脅迫的關鍵物質，可以降低ROS對組織的毒害作用[3-4]。總抗氧化能力(T-AOC)作為衡量抗氧化酶系統(tǒng)的功能情況的綜合能力的高低，用來反映機體抗氧化能力的綜合性指標[3-5]。因此，上述抗氧化物質活性強弱或含量多少，常常被用來作為水生生物受重金屬暴露脅迫的指標[2,4]。脂質過氧化物是生物體細胞受到氧化脅迫和損傷的產物[4,6]，丙二醛(MDA)是脂質過氧化的終產物，因此，組織中MDA的含量常用來反映活性氧對組織造成脂質過氧化程度的指標[1-2,6]。

魚體組織特別是肝和腎作為應對外來物質(如重金屬，有機污染物等)引起的氧化脅迫主要解毒器官，其中組織中富含有抗氧化物質[2-4,7]。鰓組織是重金屬通過水體途徑暴露進入體內首要目標器官[3-5,7]。因此，這些器官常被選取作為評估魚體受到重金屬暴露而引起的氧化脅迫的標志性器官。本研究探討了胚胎-仔魚期南方鲇(Silurusmeridionalis)受到不同濃度Pb暴露對其鰓、肝臟和腎臟組織中的氧化脅迫作用，為闡明環(huán)境中重金屬Pb造成魚類體內氧化損傷和機體抗氧化機制變化的研究提供基礎資料，以及為水產養(yǎng)殖過程中水環(huán)境適宜的重金屬含量監(jiān)控提供參考資料。

1 材料及方法

1.1 實驗卵來源及養(yǎng)殖條件

2014年5月，在西南大學生命科學學院水生生物及水環(huán)境研究所養(yǎng)殖場獲取性成熟南方鲇雌雄魚(♀：9.5 kg、98.60 cm；♂：3.8 kg、78.00 cm)，根據謝小軍[8]提出的南方鲇人工受精法獲得受精卵。將受精卵轉移至實驗室溫度馴化，在適應馴化約4 h后挑取達囊胚早期發(fā)育階段的胚胎附著于直徑為11 cm的圓形濾網上，每個濾網附著250粒受精卵，把濾網放置于水族箱(長×寬×高=35 cm×20 cm×32 cm)中進行孵化。每個水族箱裝30 L人工配制的軟水，按實驗設計濃度加入Pb母液配制成實驗水體。每24 h更換1/2的實驗用水，置換出的廢棄水經活性炭處理后排放。用充氣泵向水族箱充氧，實驗期間水中溶氧維持在5 mg/L以上。pH為7.68±0.05。水族箱放入水浴箱中控制水溫在(25±0.5)℃。光周期為12L∶12D，瞬時開斷。

仔魚出膜后，隨機挑取仔魚，根據表1設計進行鉛暴露試驗，其中每個濃度組5個重復，每一重復50尾仔魚，于循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)8周，循環(huán)系統(tǒng)由1個蓄水箱(長×寬×高=85 cm×50 cm×70 cm)和10個養(yǎng)殖水箱(長×寬×高=39 cm×27 cm×25 cm)組成。飼養(yǎng)期間水溫維持(27.5±1)℃，光周期為12L∶12D，每48 h更換1/2的實驗用水，置換出的廢棄水經活性炭處理后排放。

1.2 實驗儀器及試劑

采用純水系統(tǒng)制備的去離子水為水源，參照GB/T13267-91[9]和Mager等[10]的方法，用CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2SO4、NaHCO3配制為水體硬度為25 mg/L的實驗用水。以Pb(NO3)2為實驗水體鉛離子源試劑，先配制成Pb2+濃度為10 g/L的母液儲藏備用，根據實驗所需稀釋成不同濃度，作為各實驗處理組養(yǎng)殖用水。

實驗儀器：純水系統(tǒng)(LD-3000G-A2，重慶利迪實驗儀器有限公司)、手持勻漿器(10 D-79219，Janke & Kunkel-Str，德國)、冷凍離心機(Centrifuge 5415R，德國Eppendorf)、酶標儀(Spectrax190，Molecular devices)、恒溫水浴箱(GFL1004，德國GFL)、恒溫水浴鍋(HH2，金壇市白塔新寶儀器廠)。

實驗試劑： MgSO4·7H2O、K2SO4、NaHCO3、Pb(NO3)2(成都市科龍化工試劑廠(AR))、CaCl2·2H2O(重慶博藝化學試劑有限公司(AR))、T-AOC試劑盒(南京建成生物技術有限公司)。

1.3 實驗設計

根據漁業(yè)水質標準(GB11607-89)和我國地表水環(huán)境質量標準(GB3838-2002)規(guī)定的鉛限量標準作為參考，結合初孵仔魚96 h LC50和預實驗結果，慢性實驗水體設置的鉛濃度分別為0、50、100、200、400 μg/L(表1)。每天8∶00和18∶00各投喂一次達飽足，投喂30 min后用虹吸法收集殘餌及糞便。

實驗分為4個處理組分別為：對照組(0-0)、恢復組(Pb-0)、持續(xù)組(Pb-Pb)和半持續(xù)組(0-Pb)。

對照組(0-0)：胚胎期和仔魚期，飼養(yǎng)的水體中都未加入硝酸鉛條件下養(yǎng)殖8周。

恢復組(Pb-0)：胚胎期受不同濃度鉛暴露，實驗結束后轉移至未加入硝酸鉛的實驗水體中養(yǎng)殖8周，即為：50-0、100-0、200-0和400-0 μg/L。

半持續(xù)組(0-Pb)：胚胎在凈水中孵化出膜，出膜后轉移至設計濃度的鉛水體中飼養(yǎng)8周。即為： 0-50、0-100、0-200、0-400 μg/L。

持續(xù)組(Pb-Pb)：胚胎期在不同濃度鉛暴露下出膜，出膜后仔魚在相應濃度條件下暴露8周。即為：50-50、100-100、200-200、400-400 μg/L。

在8周喂養(yǎng)實驗結束后，實驗魚經MS222麻醉后解剖，迅速取出腦、鰓、肝臟和腎臟用于乙酰膽堿酯酶和抗氧化酶的活性測定。

1.4 各項指標測定及計算方法

1.4.1 勻漿液的制備

實驗結束后，南方鲇經MS222麻醉后解剖，迅速取出腦、鰓、肝臟和腎臟組織用預冷的0.05 mol/L的磷酸鹽(PBS)緩沖液沖洗后，用濾紙除去器官表面多余的液體，裝入1.5 mL離心管中用液氮速凍后轉移至-80 ℃保存待測。測定前把組織器官置于冰浴中解凍，取約0.2 g組織剪碎，按重量與體積比(g∶mL)為1∶10的比例加入10倍體積的PBS預冷勻漿液，冰水浴條件下機械勻漿。在溫度為4 ℃的離心機中轉速為9 000g離心10 min，取上清液轉移到1.5 mL離心管中用于T-AOC、SOD、CAT、GSH、MDA、TChE和蛋白質含量的測定。上述操作過程均在溫度為0～4 ℃條件下完成。

1.4.2 腦乙酰膽堿酯酶(TChE)活性測定

乙酰膽堿酯酶活性測定采用酶標儀參照Ellman等[11]提供的方法測定。TChE活性(nm/(min·mg protein))=((樣品OD值-對照OD值)/min×反應體積)/(消光系數×樣品體積×光徑)/蛋白含量。

表1 南方鲇胚胎期和仔魚期(Pb)暴露試驗Tab.1 The study of lead exposure embryos and larvae of S.meridionalis μg/L

1.4.3 鰓、肝和腎組織中總抗氧化能力(T-AOC)測定

采用T-AOC試劑盒測定T-AOC活性。在27.5 ℃條件下，每分鐘每毫克組織蛋白使反應體系中吸光值，每增加0.01時，定義為一個T-AOC單位(U)。

1.4.4 鰓、肝和腎組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

超氧化物歧化酶活性測定采用鄰苯三酚自氧化法測定[12]。每分鐘抑制每毫升反應液中抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個SOD活力單位。

1.4.5 鰓、肝和腎組織中過氧化氫酶(CAT)活性測定

過氧化氫酶活性測定參照Beers & Sizer[13]的方法。一個CAT活力單位定義為每分鐘催化分解1 μmol過氧化氫。

1.4.6 鰓、肝和腎組織中谷胱甘肽(GSH)含量測定

谷胱甘肽含量采用分光光度法測定[14]。用還原型谷胱甘肽物質作為標準樣品，采用酶標儀在412 nm處測得吸光值繪制標準曲線，再根據標準曲線計算出樣品GSH含量(mg/mg protein)。

1.4.7 鰓、肝和腎組織中丙二醛含量(MDA)測定

MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[15]。

1.4.8 樣品蛋白質含量測定

樣品蛋白質采用考馬斯亮藍法測定[16]，蛋白質含量用mg/L表示。

1.5 數據處理方法

采用Excel(2007)、SPSS(17.0)軟件進行相關數據的整理及統(tǒng)計分析，統(tǒng)計數據以平均值±標準誤(Mean±S.E)表示，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析(Alysisofvarianee，ANOVA)及最小顯著差數法(Least significant difference，LSD)多重比較，以P<0.05作為數據均值差異達到顯著性的標準。

2 結果

2.1 水體中Pb暴露對南方鲇鰓、肝臟和腎臟組織中總抗氧化能力(T-AOC)的影響

恢復組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC活性表現出恢復效應，其中400-0 μg/L鉛濃度水平實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織T-AOC活性顯著高于對照組(P<0.05)。持續(xù)組和半持續(xù)組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC活性受到抑制，T-AOC活性隨著水體中Pb濃度升高而逐漸降低。半持續(xù)組和持續(xù)組這三種組織中T-AOC活性均顯著低于對照組(P<0.05)，而相同濃度水平時，兩實驗組之間T-AOC活性不存在明顯差異(P<0.05)(表2)。

表2 水體鉛暴露對南方鲇幼魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC活性的影響Tab.2 Effects of different lead concentration on the activity of T-AOC in gill，liver，kidney of S.meridionalis

續(xù)表2

注：數據用平均值±標準誤表示(mean±S.E，n=5)，a、b、c：同列中具有不同上標用來表示不同水體濃度水平，相同處理組之間差異性(P<0.05)；x、y、z：表示同行中相同Pb濃度水平，不同處理組之間差異性(P<0.05)。表3,4同。

2.2 水體中Pb暴露對南方鲇鰓、肝臟和腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

恢復組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中SOD活性被輕微的誘導，在最高濃度水平(400-0 μg/L)三種組織中SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。持續(xù)組和半持續(xù)組三種組織中SOD活性被抑制，隨著濃度升高而降低，在200和400 μg/L濃度條件下，這三種組織SOD活性均顯著低于對照組(P<0.05)(表3)；50 μg/L濃度水平肝臟和腎臟組織SOD活性被誘導，顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。

表3 水體鉛暴露對南方鲇幼魚鰓、肝臟和腎臟組織中SOD活性的影響Tab.3 Effects of different Lead concentration on the activity of SOD in gill，liver，kidney of S.meridionalis

2.3 水體Pb暴露對南方鲇鰓、肝臟和腎臟組織中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

恢復組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中CAT活性表現出恢復效應，胚胎期受最高濃度暴露實驗魚三種組織中CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)。持續(xù)組和半持續(xù)組三種組織中CAT活性被抑制，隨著Pb濃度升高而降低，在200和400 μg/L濃度條件下，這三種組織CAT活性均顯著低于對照組(P<0.05)；在相同濃度水平下，兩處理組之間CAT活性無明顯差異(P<0.05)(表4)。

表4 水體鉛對暴露南方鲇幼魚鰓、肝臟和腎臟組織中CAT活性的影響Tab.4 Effects of different Lead concentration on the activity of CAT in gill，liver，kidney of S.meridionalis

2.4 水體中Pb暴露對南方鲇鰓、肝臟和腎臟組織中谷胱甘肽(GSH)含量的影響

水體中Pb暴露會降低實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中GSH含量。持續(xù)組和半持續(xù)組這三種組織中GSH含量隨著Pb濃度升高而降低，均顯著低于對照組(P<0.05)(圖1-3)；相同濃度水平下，這三種組織中GSH含量在半持續(xù)組和持續(xù)組之間無明顯差異(P<0.05)(圖1-3)。

圖1 水體鉛暴露對南方鲇幼魚鰓中GSH含量的影響Fig.1 Effects of different lead concentration on the contents of GSH in gill of S.meridionalis *表示處理組與空白組差異達顯著水平(P<0.05)。 圖2-7同。

2.5 水體中Pb暴露對南方鲇鰓、肝臟和腎臟組織的丙二醛(MDA)含量的影響

鉛暴露會引起南方鲇組織氧化損傷，實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中MDA含量隨著水體中Pb濃度升高而升高。MAD含量只在400 μg/L濃度水平時顯著高于對照組(P<0.05)。相同濃度水平下，半持續(xù)組和持續(xù)組實驗魚三種組織中MDA含量差異不顯著(P<0.05)(圖4-6)。

圖2 水體鉛暴露對南方鲇幼魚肝臟中GSH含量的影響Fig.2 Effects of different lead concentration on the contents of GSH in liver of S.meridionalis

圖3 水體鉛暴露對南方鲇幼魚腎臟中GSH含量的影響Fig.3 Effects of different lead concentration on the contents of GSH in kidney of S.meridionalis

圖4 水體鉛暴露對南方鲇幼魚鰓中MDA含量的影響Fig.4 Effects of different lead concentration on the contents of MDA in gill of S.meridionalis

圖5 水體鉛暴露對南方鲇幼魚肝臟中MDA含量的影響Fig.5 Effects of different lead concentration on the contents of MDA in liver of S.meridionalis

圖6 水體鉛暴露對南方鲇幼魚腎臟中MDA含量的影響Fig.6 Effects of different lead concentration on the contents of MDA in kidney of S.meridionalis

2.6 水體中Pb暴露對南方鲇腦組織中乙酰膽堿酯酶(TChE)活性的影響

水體中鉛暴露降低了南方鲇腦組織TChE活性，其活性隨著Pb濃度升高逐漸降低，且顯著低于對照組(P<0.05)(圖7)。半持續(xù)組和持續(xù)組實驗魚腦組織中TChE活性顯著低于對照組(P<0.05)。但相同濃度條件下，半持續(xù)組和持續(xù)組之間TChE活性無明顯差異(P<0.05)。

圖7 水體鉛暴露對南方鲇腦乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig.7 Effects of different lead concentration on the activity of Acetlcholinesterase (TChE)in brains of S.meridionalis

3 討論

3.1 鉛對南方鲇抗氧化能力的影響

重金屬進入魚體內后，會打破體內活性氧(ROS)產生和清除的平衡，引起ROS含量升高，發(fā)生氧化脅迫[2-4]。本研究結果表明恢復組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC、SOD、CAT活性隨著Pb濃度升高表現出恢復效應，MDA含量也隨濃度升高而升高，而GSH含量隨濃度上升呈下降趨勢；表明實驗魚在胚胎期受到重金屬暴露，經過后期恢復實驗魚機體抗氧化系統(tǒng)的能力會進行自我調整來應對Pb暴露引起的ROS毒性脅迫作用，前人也有類似報道?？肆掷资霄T(Rhamdiaquelen)受重金屬暴露后再恢復飼養(yǎng)，肝、鰓和腎組織中T-AOC、SOD、CAT活性同樣表現出恢復的趨勢[17]。

持續(xù)組和半持續(xù)組三種組織中T-AOC、SOD、CAT活性以及GSH含量隨暴露濃度升高而逐漸降低，而MDA含量隨水體中Pb濃度升高而升高，表現出濃度劑量效應。水體中重金屬暴露降低了矛尾復鰕虎[18](Synechogobiushasta)、黃河鯉[19](Oreochromisniloticus)和金魚[20](Carassiusauratus)肝、鰓和腎組織中T-AOC、CAT、SOD活性。牙鲆[5](Paralichthysolivaceus)、金頭鯛[21](Sparusaurata)受重金屬暴露會引起肝、腎組織中MDA含量升高，脂質過氧化程度加劇。重金屬可以對T-AOC、SOD、CAT和GSH的合成過程產生抑制以及破壞其結構，進而對其活性產生不利影響[22]。此外，當重金屬在魚體內引起ROS的含量超過自身抗氧化系統(tǒng)解毒清除能力，各種抗氧化物質會消耗殆盡，造成抗氧化保護機制受損[2,5]。本研究中持續(xù)組和半持續(xù)組實驗魚肝、鰓和腎臟組織中T-AOC、SOD、CAT活性水平和MDA含量隨著Pb濃度，表現出濃度劑量效應(圖4-6)。這提示了重金屬長期暴露后，會引起大量的Pb在體內組織中累積，引起ROS含量升高超過機體自身抗氧化解毒清除的水平，造成抗氧化調節(jié)機制受損，降低了實驗魚抗氧化系統(tǒng)的應激能力。

相同Pb濃度條件下，持續(xù)組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC、SOD、CAT活性以及GSH含量略低于半持續(xù)組，此外，這三種組織中MDA含量略高于半持續(xù)組，表明胚胎期和仔魚期重金屬暴露存在疊加效應；但這兩個處理組中，相同濃度水平中同種酶之間差異未達顯著水平，由于胚胎期卵膜可以阻滯大量的重金屬進入胚胎，降低重金屬對胚胎期的毒害作用[23-24]，因此，胚胎期和仔魚期受重金屬暴露，其毒性影響主要發(fā)生在仔魚期；再根據恢復組、半持續(xù)組和持續(xù)組結果比較，也支持了鉛暴露引起實驗魚的氧化脅迫毒性作用主要發(fā)生在仔魚期的觀點。

3.2 鉛對南方鲇腦神經系統(tǒng)的影響

乙酰膽堿酯酶(TChE)在魚體正常的生理過程中，如捕獵食物、逃避捕食和發(fā)現異性等，具有重要作用。因此，常選取腦組織中TChE活性，來作為其受到污染物毒害作用的指標[25-26]。有研究表明，無論是單一金屬還是混合金屬暴露都會對TChE活性起抑制作用[11,27]。金頭鯛在受到水體Pb暴露后，腦組織中TChE活性顯著降低[21]。本研究中，南方鲇腦組織中TChE活性隨著水體Pb濃度升高而降低，表明Pb引起魚體神經系統(tǒng)中TChE活性降低，調節(jié)功能發(fā)生紊亂，對魚體行為產生影響。而羅其勇等[24]在仔魚急性實驗研究中，觀察到水體中Pb暴露會引起南方鲇仔魚行為異常，且隨著Pb濃度升高而更加明顯，這些現象可能就是魚體神經系統(tǒng)中毒而引起的運動失調和行為異常。

4 結論

恢復組實驗結果表明，胚胎受鉛暴露經過后期的恢復飼養(yǎng)，實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC、SOD、CAT活性、GSH以及MDA含量表現出恢復效應，表明機體抗氧化的能力會進行自我調整來應對Pb暴露引起的毒性脅迫作用。

半持續(xù)暴露和持續(xù)組實驗魚鰓、肝臟和腎臟組織中T-AOC、SOD、CAT活性和GSH含量降低，MDA含量升高，均表現出濃度劑量效應，表明重金屬長期慢性暴露會對實驗魚抗氧化系統(tǒng)的調節(jié)能力產生不利影響；胚胎期和仔魚期重金屬暴露存在疊加效應，且對仔魚期的毒性作用更加劇烈。腦組織中乙酰膽堿酯酶(TChE)活性隨暴露濃度升高而逐漸降低，這可能是重金屬暴露引起仔魚行為異常的重要原因之一。

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