封 琦，朱光來(lái)，王建國(guó)，齊富剛，熊良偉，王 權(quán)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院水產(chǎn)科技學(xué)院，江蘇泰州 225300)

中華鳑鲏(Rhodeussinensis)是鯉形目鯉科鳑鲏屬的一種小型底棲型魚(yú)類(lèi)，不僅具有很高的觀賞價(jià)值，而且在養(yǎng)殖實(shí)踐中還可用作“生態(tài)魚(yú)”，對(duì)水體環(huán)境起到指示預(yù)警作用[1]。氨氮作為養(yǎng)殖水體中重要的環(huán)境因子，一直是水質(zhì)監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一。氨氮主要來(lái)自于水體中的外源有機(jī)物分解以及水生動(dòng)物自身的內(nèi)源排泄物[2]。氨氮不僅會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的鰓表皮細(xì)胞造成損害，從而影響呼吸作用；還會(huì)對(duì)肝腎組織造成破壞，并導(dǎo)致非特異性免疫抑制效應(yīng)[3-4]。目前有關(guān)氨氮對(duì)魚(yú)類(lèi)作用的研究主要集中在兩方面，一方面?zhèn)戎赜趶沫h(huán)境污染評(píng)估角度尋找分子標(biāo)記物[3,5]；另一方面則從免疫、代謝角度研究氨氮毒性作用機(jī)理[6-8]。研究對(duì)象則主要以斑馬魚(yú)等模式生物以及主要養(yǎng)殖商品魚(yú)類(lèi)為主[4-5,9-15]。氨氮對(duì)中華鳑鲏的作用影響則未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。已有研究表明氨氮長(zhǎng)期暴露會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的免疫能力，抗應(yīng)激能力造成抑制作用[16-17]。堿性磷酸酶(Alkalinephosphates，AKP)是一種常見(jiàn)的免疫標(biāo)志酶[18]。李波等[19]發(fā)現(xiàn)在慢性氨氮脅迫下，黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)血液中AKP酶活性升高較快。過(guò)氧化氫酶(Catalyse，CAT)是生物抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在生物毒性評(píng)價(jià)中有重要意義。Sinha等[20]認(rèn)為常見(jiàn)鯉科魚(yú)類(lèi)(錦鯉Cyprinuscarpio和金魚(yú)Carassiusauratus)在遇到氨氮刺激時(shí)，肝臟中的CAT將組成抗氧化應(yīng)激的首道防線，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。本研究以氯化銨模擬水體中氨氮，研究了氨氮對(duì)中華鳑鲏急性毒性，并根據(jù)急性毒性結(jié)果進(jìn)一步探明了氨氮脅迫下中華鳑鲏血清中過(guò)氧化氫酶(CAT)和堿性磷酸酶(AKP)的響應(yīng)變化，為中華鳑鲏健康養(yǎng)殖中的水質(zhì)管理提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華鳑鲏購(gòu)自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院?jiǎn)⒑剿宓?，試?yàn)前在1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中暫養(yǎng)兩周。暫養(yǎng)期間，正常投喂配合飼料，每天清除排泄物，水溫維持在(25±1)℃，pH為7.4±0.1。挑選健康、活潑的個(gè)體(體重(0.628±0.006)g，體長(zhǎng)(3.989±0.290)cm用于試驗(yàn)。

測(cè)定酶活性所用的試劑盒(CAT、AKP)均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司,NH4Cl及其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

急性毒性試驗(yàn)采用靜水法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置6個(gè)濃度組200、230、260、290、320、360 mg/L和1個(gè)空白對(duì)照，每組3個(gè)平行。不同濃度的測(cè)試液采用0.01 mol/L磷酸緩沖液(維持pH 7.4左右)添加適量NH4Cl制備成，每組水量10 L。每個(gè)濃度組隨機(jī)加入20尾活力良好的中華鳑鲏，24 h后計(jì)數(shù)死亡個(gè)體數(shù)。

在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按1/10、1/20、1/30 LC50設(shè)置高、中、低3個(gè)處理組，每組處理3個(gè)平行；每個(gè)處理組20條魚(yú)，其余試驗(yàn)條件同急性毒性測(cè)試；分別于0、24、48、72 h隨機(jī)取出5尾，采用1 mL無(wú)菌注射器圍心腔取血，合并置于無(wú)菌離心管中，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，立即測(cè)定CAT、AKP酶活性，測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用概率單位法分析，為檢驗(yàn)氨氮高、中、低濃度對(duì)CAT和SOD酶活性的時(shí)間變化影響，采用雙因素方差(two-way ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(固定因子為氨氮濃度和暴露時(shí)間)。方差分析之前,檢驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)是否滿足正態(tài)性(Shpiro-Wilk)及方差齊性(Levene’s test)。如果數(shù)據(jù)方差不齊,則進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換使之滿足方差齊性。交互作用顯著時(shí),通過(guò)MANOVA語(yǔ)句分別檢驗(yàn)氨氮濃度或暴露時(shí)間處理在另一因素不同水平上的簡(jiǎn)單效應(yīng)[21-22]；交互作用不顯著時(shí)，分析氨氮濃度和暴露時(shí)間的主效應(yīng)，并采用Bonferroni法進(jìn)行事后多重比較，所有計(jì)算均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 24.0完成。

2 結(jié)果

2.1 氨氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性作用

中華鳑鲏放入測(cè)試液中不久，就觀察到高濃度組320、360 mg/L中出現(xiàn)上浮現(xiàn)象，3 h后魚(yú)體失去平衡，12 h后出現(xiàn)體表充血、死亡現(xiàn)象，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。采用概率單位法計(jì)算得到氨氮對(duì)中華鳑鲏24 h LC50(95%置信區(qū)間)為263.28 mg/L(200.97～344.93 mg/L)；毒力回歸方程為：y=-24.404 4+12.148 5x，r=0.945 2。

表1 氨氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性效應(yīng)

2.2 氨氮對(duì)中華鳑鲏血清CAT活性的影響

由表2可知，高中低三個(gè)劑量組中CAT酶活性均隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由圖1可見(jiàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CAT酶活性隨著氨氮?jiǎng)┝吭龈叱尸F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。雙因素方差分析表明：氨氮濃度和暴露時(shí)間均會(huì)對(duì)CAT酶活性造成顯著影響，其中暴露時(shí)間對(duì)CAT酶活性影響作用極顯著，并且兩因素之間存在顯著的交互作用(見(jiàn)表3)。簡(jiǎn)單效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果顯示暴露時(shí)間對(duì)CAT酶活性的作用受到不同氨氮濃度的影響(MANOVA,9 mg/L:F3,26=15.06，P<0.01；13 mg/L，F(xiàn)3,26=12.23，P<0.01；26 mg/L，F(xiàn)3,26=30.08，P<0.01)。

圖1 氨氮濃度對(duì)中華鳑鲏血清CAT酶活性的作用影響

表2 不同暴露時(shí)間對(duì)中華鳑鲏血清CAT酶活性的影響

表3 氨氮和暴露時(shí)間對(duì)中華鳑鲏血清CAT酶活性的雙因素方差分析

注：加粗?jǐn)?shù)字表明差異顯著P<0.05。表5同。

2.3 氨氮對(duì)中華鳑鲏血清AKP酶活性的影響

由表4可知，低劑量組中AKP酶活性均隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在中、高劑量組則呈現(xiàn)隨時(shí)間下降趨勢(shì)。由圖2可見(jiàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AKP酶活性隨著氨氮?jiǎng)┝吭龈叱尸F(xiàn)下降的趨勢(shì)。雙因素方差分析表明：氨氮濃度和暴露時(shí)間均會(huì)對(duì)AKP酶活性影響極顯著，并且兩因素之間存在極顯著的交互作用(見(jiàn)表5)。MANOVA檢驗(yàn)結(jié)果顯示氨氮濃度在暴露時(shí)間24 h和48 h兩個(gè)水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)極顯著(24 h:F3,27=7.80，P<0.01；48 h，F(xiàn)3,27=15.24，P<0.01)；暴露時(shí)間在氨氮濃度9 mg/L水平上簡(jiǎn)單效應(yīng)極顯著(F3,26=9.42，P<0.01)。

圖2 氨氮濃度對(duì)中華鳑鲏血清AKP酶活性的作用影響

表4不同暴露時(shí)間對(duì)中華鳑鲏血清AKP酶活性的影響

Tab.4EffectsofexposuretimeonactivityofAKPinserumofR.sinensis(x±s,n=3)

金氏單位/100 mL

表5 氨氮和暴露時(shí)間對(duì)中華鳑鲏血清AKP酶活性的雙因素方差分析

3 討論

3.1 氨氮對(duì)中華鳑鲏的急性毒性

氨氮普遍存在于水體環(huán)境中，其主要來(lái)源于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水排放以及生物廢棄物降解。氨氮對(duì)所有脊椎動(dòng)物均有毒性作用，會(huì)造成痙攣、昏迷以及死亡等癥狀[23]。水環(huán)境中高濃度的氨氮會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，造成肝組織病理變化及細(xì)胞凋亡[24]；還會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生明顯的遺傳毒性作用[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)在水溫25 ℃，pH 7.4的條件下，中華鳑鲏對(duì)氨氮有較強(qiáng)的耐受性。氨氮對(duì)中華鳑鲏的24 h LC50(263.28 mg/L)要高于此前報(bào)道的斑馬魚(yú)(126 mg/L)[25]、青魚(yú)幼魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)(80.98 mg/L)[13]、團(tuán)頭魴幼魚(yú)(Megalobramaamblycephala)(65.277 mg/L)[4]、白斑狗魚(yú)幼魚(yú)(Esoxlucius)(34.36 mg/L)[9]以及鱖(Megalobramaamblycepha(a))(35.51 mg/L)[26]。氨氮對(duì)水生生物的毒性主要受到水體溫度、pH、離子強(qiáng)度的影響；尤其pH對(duì)其毒性效應(yīng)影響顯著(酸性時(shí)毒性降低，堿性時(shí)毒性變強(qiáng))。本試驗(yàn)所采用的溫度和pH條件參考了此前研究報(bào)道，排除了主要外在因素的干擾，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的可比性。研究表明魚(yú)類(lèi)可以采用某些生理代謝機(jī)制，保護(hù)自身免受外界環(huán)境中的氨氮刺激：有許多硬骨魚(yú)類(lèi)在高濃度氨氮環(huán)境中，腦部能夠主動(dòng)激活谷氨酰胺合成，再釋放到血液中，作為無(wú)毒載體將氨氮從不同組織運(yùn)送到肝臟中進(jìn)行代謝[27-28]；還有有些魚(yú)類(lèi)在受到氨氮脅迫時(shí)，可以通過(guò)降低蛋白以及氨基酸水解速率以減緩氨氮產(chǎn)生，從而降低氨氮毒性[23]。王建國(guó)等[29]研究發(fā)現(xiàn)中華鳑鲏的排氨率遠(yuǎn)低于沙塘鱧等魚(yú)，因此中華鳑鲏可能主要依靠上述機(jī)制來(lái)減少氨氮毒性。此外Clifford等[30-31]以一種深海“清道夫”—太平洋八目鰻(Eptatretusstoutii)為研究對(duì)象，對(duì)其氨氮耐受性進(jìn)行了研究，他們認(rèn)為魚(yú)類(lèi)中普遍存在的一類(lèi)NH4+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)hesus (Rh)糖蛋白在氨氮排泄中起著十分重要的作用。中華鳑鲏生活在水體中下層、能攝食腐肉等生態(tài)特征與太平洋八目鰻等高氨氮耐受性魚(yú)類(lèi)相近，因此中華鳑鲏也可能存在相似生理機(jī)制來(lái)抵御氨氮刺激。

3.2 統(tǒng)計(jì)方法比較

此前的報(bào)道中多采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較的方法對(duì)不同濃度組和時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均發(fā)現(xiàn)時(shí)間對(duì)氨氮毒性有一定影響，但并未對(duì)暴露時(shí)間和濃度的交互作用進(jìn)行驗(yàn)證[5,19,32-34]。本研究中采用雙因素方差分析方法，對(duì)兩者的交互作用進(jìn)行了詳細(xì)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)暴露時(shí)間和濃度對(duì)CAT和AKP的酶活性均存在交互作用；并且采用MANOVA語(yǔ)句對(duì)各因子不同水平上的簡(jiǎn)單效應(yīng)進(jìn)行了分析，規(guī)避了此前的統(tǒng)計(jì)分析漏洞。

3.3 氨氮對(duì)CAT酶活性的作用

已有報(bào)道表明養(yǎng)殖水體中的氨氮會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)的血清抗氧化系統(tǒng)造成損害[35]。CAT作為魚(yú)體中一類(lèi)重要的抗氧化酶類(lèi)，常被用作生物標(biāo)志物，可用來(lái)預(yù)測(cè)環(huán)境中的氨氮污染[25,32,36]。本研究發(fā)現(xiàn)在氨氮脅迫下，CAT酶活性隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)總體呈下降趨勢(shì)，并且在同一時(shí)間點(diǎn)會(huì)隨著氨氮?jiǎng)┝吭龈叱尸F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；該現(xiàn)象與韓力強(qiáng)[37]、許星鴻等[25]的觀察結(jié)果一致。這說(shuō)明氨氮對(duì)CAT具有抑制作用；在低濃度范圍內(nèi)隨著氨氮濃度增加，CAT酶活性隨之增加以維持體內(nèi)氧化還原平衡，當(dāng)氨氮超過(guò)一定濃度范圍后，將對(duì)機(jī)體造成損傷，從而導(dǎo)致酶活性下降。此外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明CAT酶活性受到濃度和暴露時(shí)間二者的顯著影響，這說(shuō)明氨氮對(duì)中華鳑鲏的毒性效應(yīng)與濃度和暴露時(shí)間密切相關(guān)，與其余報(bào)道的研究結(jié)論相一致[6,10,14]。

3.4 氨氮對(duì)AKP酶活性的影響

AKP是一種參與磷代謝的水解酶，常被用作免疫學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)環(huán)境污染[38-40]。艾春香等[41]研究發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹AKP對(duì)氨氮脅迫比較敏感。在氨氮脅迫初始階段，低劑量組中AKP酶活性呈上升趨勢(shì)，而在中高濃度組呈下降趨勢(shì)。這說(shuō)明在低濃度氨氮脅迫下，機(jī)體能夠主動(dòng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)以提高AKP酶活性；當(dāng)氨氮濃度高于9 mg/L時(shí)，將超過(guò)機(jī)體調(diào)節(jié)范圍，并對(duì)AKP產(chǎn)生抑制作用。另外，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，AKP最終呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)氨氮會(huì)對(duì)AKP酶活性產(chǎn)生抑制作用，破壞魚(yú)體免疫力，從而引起病害發(fā)生。

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