朱成科，王 建，周 燕，雷 駱，鄧星星，蒲德成，鄭宗林，周朝偉，鄭永華

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；2.巫溪縣農(nóng)業(yè)委員會(huì)，重慶 405899； 3.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 400716)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于氣單胞菌科(Aeromondaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種條件致病菌，廣泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中[1]，在繁殖過程中產(chǎn)生黏附素、細(xì)胞毒素、腸毒素、氣溶素和溶血素等毒力因子，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人都有較高的致病性，為一種典型的人—獸—魚共患病病原菌[2]。常引起蝦、蟹、蚌、魚、蛙和鱉等水生生物細(xì)菌性敗血癥、體表出血、腐皮病、爛尾病等多種疾病[3-5]，該菌引發(fā)的疾病具有發(fā)病快、死亡率高的特點(diǎn)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來巨大的損失。

目前，盡管已有維氏氣單胞菌滅活疫苗研究報(bào)道，但受病原菌血清型、免疫方式、魚體自身特點(diǎn)等因素制約，致使免疫效果較差或不穩(wěn)定[6,7]。因此，現(xiàn)在對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病大多仍采用抗生素和合成藥物來控制其發(fā)生和流行[8]，然而大量、長期使用容易導(dǎo)致病原菌出現(xiàn)耐藥性增強(qiáng)，同時(shí)對(duì)水生態(tài)環(huán)境以及藥物殘留引起的水產(chǎn)品質(zhì)量安全等負(fù)面影響備受人們關(guān)注[9]。所以急需尋找一種安全高效的新型水產(chǎn)藥物用于維氏氣單胞菌病的防治。

中草藥種類豐富，分布廣泛，在治療人類和動(dòng)物疾病方面具有悠久的歷史，抑殺菌效果明顯[10]。與抗生素相比，中草藥具有無殘留、無抗藥性、毒副作用弱、對(duì)環(huán)境不易造成污染的特點(diǎn)[11]，同時(shí)，中草藥還具有免疫調(diào)節(jié)、補(bǔ)充營養(yǎng)和提高生產(chǎn)性能等作用，符合綠色健康養(yǎng)殖的要求[3,12]。選取150種具有廣譜抗菌活性的中草藥，研究其提取物對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌作用，以期在實(shí)踐中篩選出對(duì)其體外抑制作用較好的中草藥，為該菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病提供科學(xué)用藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試維氏氣單胞菌株RC110724(登錄號(hào)：KC663719)由西南大學(xué)榮昌校區(qū)水產(chǎn)系魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心從患病黃顙魚的肝、脾等內(nèi)臟組織中分離、鑒定[1]，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?50種中草藥(表1)均購買于重慶市榮昌區(qū)東風(fēng)大藥房。

試驗(yàn)用普通肉湯液體培養(yǎng)基配方為：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH值調(diào)至7.2～7.4，121℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基為每1000 mL液體培養(yǎng)基加入15 g瓊脂粉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備

將維氏氣單胞菌菌株RC110724接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩(200 r/min)培養(yǎng)4～6 h，取200 μL菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 h，在藥效試驗(yàn)開始前，無菌蒸餾水洗下菌苔，采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛认♂屩?×107CFU/mL，待用。

1.2.2 中草藥藥液的制備

150種中草藥除大蒜外放入60 ℃干燥6 h后各取20.0 g，以400 mL蒸餾水浸泡2 h后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，4層紗布過濾，殘?jiān)偌尤?00 mL蒸餾水，煎煮2次，合并所得藥液，濃縮至20 mL，使其終濃度為1.0 g/mL，調(diào)pH值至中性附近。121 ℃濕熱滅菌15 min，4 ℃保存待用。大蒜提取如下：挑選完好的蒜瓣，去皮，按質(zhì)量1:1加入蒸餾水，研磨成漿，100目篩絹網(wǎng)過濾，4 000 r/min離心5 min，取上清液保存于4 ℃冰箱中，當(dāng)天用[13]。

1.2.3 藥物體外抑菌試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法[14]測(cè)定。取稀釋后的菌液200 μL均勻涂布于普通瓊脂平皿(直徑為9 cm)上，待菌液干后，用直徑6 mm的滅菌打孔器在平皿上打4個(gè)孔，其中3孔加入50 μL藥液，另一孔以滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照。置于28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑的大小。參照文獻(xiàn)[15]將中藥劃分成4個(gè)等級(jí)，分別為：抑菌圈直徑大于20 mm為抑菌作用強(qiáng)，用“+++”表示；直徑15～20 mm為中等強(qiáng)度抑菌作用，用“++”表示；10～15 mm表示抑菌作用弱，用“+”表示；小于10 mm為無抑菌作用，用“-”表示。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

用二倍稀釋法測(cè)定各藥物的最低抑菌濃度(MIC)[11,16]。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將中草藥提取液加入無菌普通肉湯液體培養(yǎng)基中，至使中草藥提取液終濃度分別為：1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0 mg/mL，然后吸取上述各濃度梯度普通肉湯培養(yǎng)基2 mL于10 mL滅菌試管中，在每個(gè)試管中加入20 μL維氏氣單胞菌菌液至終濃度為1.0×105CFU/mL。置于28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h。然后觀察結(jié)果，清澈透明無渾濁現(xiàn)象的試管即為無菌生長管，無菌生長管中的最低藥物濃度就是最小抑菌濃度(MIC)，每種藥物重復(fù)3次。

1.2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

在MIC試驗(yàn)基礎(chǔ)上，把無菌生長的各管搖動(dòng)均勻，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，清澈透明無渾濁的無菌生長管中的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。并進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)，分別吸取該管及上一濃度梯度管的培養(yǎng)液0.1 mL，涂布于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌生長，最小殺菌濃度管無菌落形成則表明前面判斷正確，否則有誤，需重新開展試驗(yàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 150種中草藥提取液的抑菌效果

150種中草藥對(duì)維氏氣單胞菌的體外抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果見表1。對(duì)維氏氣單胞菌作用強(qiáng)(+++)的中草藥有五倍子、石榴皮、地榆和烏梅，抑菌圈直徑分別為(20.89±0.31)mm、(20.82±0.48)mm、(20.65±0.51)mm和(20.08±0.05)mm。中等強(qiáng)度抑菌作用(++)的有虎杖、黃柏、香薷等16種中草藥，抑菌直徑為15～20 mm。木瓜、萹蓄、桉樹葉等34種中草藥提取液表現(xiàn)出弱抑菌作用(+)，抑菌直徑為10～15 mm。海風(fēng)藤、柴胡、茵陳等96種中草藥提取物不敏感，抑菌直徑均小于10 mm。

表1 中草藥提取液對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on A.veronii

續(xù)表1

續(xù)表1

注：“+++”表示抑菌作用強(qiáng)，“++”表示抑菌作用中等，“+”表示抑菌作用弱，“-”表示無抑菌作用

2.2 MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果

選取抑菌圈直徑大于10 mm的中草藥采用二倍稀釋法測(cè)定藥物對(duì)維氏氣單胞菌的MIC和MBC，試驗(yàn)結(jié)果見表2。五倍子、地榆、石榴皮、烏梅、虎杖和訶子MIC和MBC均小于10 mg/mL，其中，五倍子抑菌作用和殺菌作用最強(qiáng)，MIC和MBC均為1.95 mg/mL，其次為地榆，其MIC為1.95 mg/mL，MBC為3.91 mg/mL；五味子、仙鶴草、香薷等13種中草藥具有較強(qiáng)的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC介于15.63 ～62.50 mg/mL之間；艾葉、香加皮、女貞子等18種中草藥具有一定的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC在125.00 ～250.00 mg/mL之間；劉寄奴、秦皮、穿心蓮等17種中草藥沒有表現(xiàn)出明顯的抑菌作用和殺菌作用，MIC和MBC均大于250 mg/mL。

表2 中草藥提取液對(duì)維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度Tab.2 MIC and MBC of Chinese herbal medicines on A.veronii mg/mL

續(xù)表2

3 結(jié)論

采用打孔法(瓊脂擴(kuò)散法)和二倍稀釋法從150種常見具有抗菌、清熱解毒特性的中草藥中篩選出五倍子、地榆、石榴皮、烏梅、虎杖和訶子對(duì)維氏氣單胞菌表現(xiàn)出了明顯的體外抑菌和殺菌活性，MIC和MBC均小于10 mg/mL，表明五倍子等6種中草藥對(duì)預(yù)防和治療由維氏氣單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病具有良好的應(yīng)用前景。

[1]朱成科，向 楨，葉 華，等.黃顙魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，35(5)：36-42.

[2]Szczuka E，Kaznowski A.Characterization ofAeromonascaviaeandA.veroniiby standardized cellular protein electrophoretic patterns[J].Folia Microbiol，2007，52(1)：65-69.

[3]潘曉藝，沈錦玉，李建應(yīng)，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(10)：1571-1576.

[4]唐 毅，鄭凱迪，朱成科，等.華鯪爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析[J].淡水漁業(yè)，2010，40(4):50-55.

[5]孫紅祥，舒妙安.中華鱉幾種常見疾病病原的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22(2)：140-145.

[6]Nakayama K，Sato K，Shibano T，et al.Occurrence of glucocorticoids discharged from a sewage treatment plant in Japan and the effects of clobetasol propionate exposure on the immune responses of common carp (Cyprinuscarpio)to bacterial infection [J].Environ Toxicol Chem，2016，35(4)：946-952.

[7]陳亨利，莫金龍，康元環(huán)，等.維氏氣單胞菌滅活疫苗的制備及對(duì)錦鯉免疫效果評(píng)價(jià)[J].中國獸醫(yī)雜志，2016，52(5)：110-113.

[8]夏 飛，梁利國，謝 駿.異育銀鯽病原維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].淡水漁業(yè)，2012，42(5)：22-26.

[9]吳穎瑞，龔慶芳，方 宏，等.153種中草藥對(duì)羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，41(1)：25-32.

[10]王文博，汪建國，李愛華，等.中草藥應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究概況[J].中國水產(chǎn)，2006，(7)：60-61.

[11]楊移斌，曹海鵬，夏永濤，等.41種中草藥對(duì)3種鱘源病原菌的體外抑菌效果[J].淡水漁業(yè)，2013，43(4)：79-84.

[12]郭秀平，何有根，林明輝，等.45種中草藥提取物對(duì)中華鱉源嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，20：125-127.

[13]曹紅峰，宋靖芳，李國慶，等.中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌ST-3-3抑菌作用的研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，13(5)：86-88.

[14]李儀奎，王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：286-292.

[15]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：43-45.

[16]陳 霞，張其中，李春濤.50種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(11)：862-865.

[17]陳 輝，張其中.100種中草藥對(duì)溶藻弧菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(6)：452-455.