倫巍巍,王俊耐

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 450015)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，化療耐藥一直是卵巢癌治療中的一大難題[1]，研究其耐藥機制是解決這一難題的關(guān)鍵。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(death domain associate protein，Daxx)于1997年在Cell雜志上首次以Fas死亡相關(guān)蛋白發(fā)表[2]，但其對細胞凋亡的影響一直備受爭議[3-4]。有學(xué)者提出Daxx參與Fas凋亡通路的調(diào)控而發(fā)揮促細胞凋亡的作用；而有大量研究證明，在人的正常細胞或者結(jié)腸癌細胞中，Daxx通過抑制凋亡基因的轉(zhuǎn)錄而最終發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[5]。已有研究表明Daxx基因在卵巢癌中普遍高表達[6]。本實驗?zāi)康脑谟诿鞔_Daxx對卵巢癌化療的影響，從而進一步明確其耐藥機制。

1 材料與方法

1.1材料 化療藥多柔比星購自美國Sigma公司(貨號CAS25316-40-9)，實驗所用卵巢癌細胞株C13k購自ATCC細胞庫?？贵wcyclinB1及抗體cleaved-parp夠自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號分別為55004-1-AP、13371-1-AP)，抗體Daxx及抗體actin購自博士德生物工程有限公司(貨號分別為PB0580、BM0005)。流式細胞儀購自美國Thermo公司(型號ABI17500)。

1.2方法

1.2.1分組 卵巢癌耐藥細胞C13k轉(zhuǎn)染后分為陰性對照組(NC組)和下調(diào)Daxx組(siDaxx組)。

1.2.2流式儀對細胞周期的檢測 C13k細胞用胰酶消化后接種于12孔板，接種第2天加化療藥多柔比星處理細胞。上述兩組細胞藥物濃度梯度均為0、0.15、0.30、0.60 μmol/L。培養(yǎng)基均為1.5 mL。藥物作用24 h后，胰酶消化細胞，1 200 r/min離心5 min，細胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗1遍，用70%冰乙醇固定細胞，于-20 ℃過夜。第2天從-20 ℃取出細胞，1 200 r/min離心5 min，再用預(yù)冷的PBS洗1遍，用10倍濃度的碘化丙啶(PI)及100倍濃度的RNA酶(RNAase)各300 μL避光染色細胞30 min，轉(zhuǎn)流式管上機分析細胞周期變化。

1.2.3流式儀對細胞凋亡的檢測 0、0.30 μmol/L的多柔比星處理上述兩組細胞24 h后，胰酶消化兩組細胞，800 r/min離心5 min，PBS輕柔漂洗1次，800 r/min離心5 min收集細胞；向收集管中加入 500 μL 結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)，輕輕搖晃，使細胞懸??；向每個收集管中加入5 μL的異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)，輕輕混勻，然后再加入5 μL PI，搖晃，使其充分混勻；于室溫下避光放置，使細胞和上述試劑充分反應(yīng) 5～15 min；避光，置于4 ℃，于1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

1.2.4Western blot C13k細胞接種于12孔板，第2天用0.30 μmol/L藥物梯度處理細胞48 h后。胰酶消化細胞，1 500 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細胞1次。用RIPA裂解細胞提取蛋白，30 μg上樣量行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳。牛奶封閉1 h，封一抗cyclinB1、cleaved-parp及內(nèi)參蛋白GAPDH，4 ℃過夜；第2天封抗兔及抗鼠二抗，TBST洗滌2 h后，曝光儀曝光。

2 結(jié) 果

2.1檢測siRNA的干擾效應(yīng) 向C13k細胞中轉(zhuǎn)入siRNA后，在未經(jīng)化療藥處理和經(jīng)化療藥處理后的Daxx表達水平均明顯降低，見圖1。

2.2流式細胞儀檢測兩組細胞周期的變化 兩組細胞的周期對比，在多柔比星0.30 μmol/L時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NC組和siDaxx組在不加藥時，均阻滯于G1期；加多柔比星化療藥后，相比與NC組，siDaxx組的G2/M期細胞百分比明顯增高，見表1。

圖1 未加及加后，siRNA的干擾效應(yīng)

表1 不同濃度的多柔比星作用下NC組及siDaxx組各細胞周期所占比例分析

圖2 未加與加0.30 μmol/L化療藥處理后兩組的細胞凋亡率比較

2.3流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡比較 不加藥時兩組凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.122)，多柔比星(0.3 μmol/L)作用時NC組的凋亡率高于siDaxx組(P=0.031)，見圖2。

2.4Western blot檢測cyclinB1、cleaved-parp的表達 siDaxx組細胞在化療藥多柔比星作用后，cyclinB1表達水平降低，細胞阻滯于G2/M期，受損的細胞DAN發(fā)生損傷修復(fù)，細胞凋亡率降低；NC組受損傷的DNA跳過G2/M期檢測位點，損傷沒有得到修復(fù)，細胞凋亡率高，見圖3。

圖3 化療藥處理后cyclineB1及cleaved-parp在兩組的表達

3 討 論

很多化療藥發(fā)生耐藥是由于腫瘤細胞DNA受損后，通過某些機制使細胞周期停滯，使受損的細胞DNA在停滯期得到有效的損傷修復(fù)[7]，從而使癌細胞逃過化療致DNA損傷的殺傷作用。

Daxx作為一種保守的多功能蛋白，通過蛋白與蛋白的相互作用或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游基因的表達，與腫瘤細胞凋亡關(guān)系密切[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)Daxx與p53結(jié)合后通過抑制p53對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，使周期相關(guān)蛋白(如p21、CDKs等)表達下調(diào)，受損的DAN不能修復(fù)而使細胞發(fā)生凋亡[10]；在人結(jié)腸癌細胞、肝癌細胞中，Daxx通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控有絲分裂檢測位點的表達，參與癌細胞凋亡[11];在卵巢癌中，過表達Daxx能夠促進卵巢癌的進展，使癌細胞發(fā)生化療耐藥，這一機制可能與Daxx轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)周期蛋白表達，使細胞周期停滯、損傷的DNA得以修復(fù)，從而使癌細胞逃過化療的殺傷產(chǎn)生耐藥有關(guān)[12]。本實驗中，在卵巢癌耐藥細胞株C13k中，利用siRNA降低Daxx蛋白的表達后，能使C13k細胞對多柔比星發(fā)生化療耐藥。進一步對這一現(xiàn)象的機制進行探討，筆者發(fā)現(xiàn)在0.30 μmol/L的多柔比星作用時，siDaxx組細胞中G2/M期調(diào)控蛋白cyclineB1表達水平下降，使C13k細胞在G2/M期發(fā)生周期阻滯，化療藥作用下?lián)p傷的DNA在這一時期得到有效的損傷修復(fù)，DNA損傷標志性蛋白cleaved-parp表達水平下降，從而對多柔比星的耐藥性增加，而這一現(xiàn)象與之前的研究[12]相反。在本實驗中，增加多柔比星的藥物濃度至0.60 μmol/L時，siDaxx組的G2/M期的阻滯作用消失，G1期細胞增加，細胞周期有繼續(xù)進展的趨勢。

Daxx作為一種多功能蛋白參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及Fas信號通路促進細胞凋亡，并作為細胞核蛋白參與染色體的穩(wěn)定作用等[13-15]。本實驗中在卵巢癌耐藥細胞系C13k細胞中下調(diào)Daxx表達后，細胞對多柔比星的耐藥性增加。尋找使Daxx表達上調(diào)的方式，可能使耐藥細胞株C13k對多柔比星化療增敏，這為卵巢癌化療耐藥的機制研究及臨床治療提供了一個新的靶點。

[1]李霞．miRNA在卵巢癌化療耐藥中的作用[J]．中國計劃生育學(xué)雜志，2013，21(12)：842-844,847．

[2]呂磊,劉志強,李麗，等.卵巢癌耐藥細胞株的比較蛋白質(zhì)組分析[J]．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2006,27(4):635-637。

[3]TANG J,PANG Q M,YANG X.Daxx is reciprocally regulated by Mdm2 and Hausp[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,393(3):542-545.

[4]RUSETSKAYA N V,LUKYANOVA N Y,CHEKHUN V F.chekhun.molecular profile and cell ccle in mcf-7 and mcf-7/dox cells exposed to conventional and liposomal forms of doxorubicin[J].Exp Oncol,2009,31(3):140-143.

[5]CORPET A,OLBRICH T,GWERDER M,et al.Dynamics of histone H3.3 deposition in proliferating and senescent cells reveals a DAXX-dependent targeting to PML-NBs important for pericentromeric heterochromatin organization[J].Cell Cycle,2014,13(2):249-267.

[6]WAN Y P,WU Y M,ZHU C M,et al.Transcriptional repression of hDaxx enhanced by adenovirus 12 EIB 55kDa oncoprotein interacting with hDaxx[J].Chin Med J，2004,117(5)：753-757.

[7]LI Q,ZHAO L Y,ZHENG Z,et al.Inhibition of p53 by adenovirus type 12 E1B-55K deregulates cell cycle control and sensitizes tumor cells to genotoxic agents[J].J Virol,2011,85(16):7976-7988.

[8]CHAUHAN S C,VANNATTA K,EBELING M C,et al.Expression and functions of transmembrane mucin MUC13 in ovarian cancer[J].Cancer Res,2009,69(3):765-774.

[9]胡坤．死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白的研究進展[J]．徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，35(5)：343-346．

[10]GOSTISSA M L,MORELLI M,MANTOVANI F,et al.The Transcriptional Repressor hDaxx Potentiates p53-dependent Apoptosis[J].JBC,2004,279(46):48013-48023.

[11]GIOVINAZZI S L,Morozov V M,SUMMERS M K,et al.USP7 and Daxx regulate mitosis progression and taxane sensitivity by affecting stability of Aurora-A kinase[J].Cell Death Differ,2013,20(5):721-731.

[12]PAN W W,ZHOU J J,LIU X M,et al.Death domain-associated protein DAXX promotes ovarian cancer development and chemoresistance[J].J Bio Chem,2013,288(19):13620-13630.

[13]YANG X，KHOSRAVI FAR R，CHANG H Y，et al．Daxx，a novel Fas bining protein that activates JNK and apoptosis[J]．Cell，1998，89(7)：1067-1076.

[14]ALI A Y,ABEDINI M R，TSANG B K.The oncogenic phosphatase PPM1D confers cisplatin resistance in ovarian carcinoma cells by attenuating checkpoint kinase 1 and p53 activation[J].Oncogene,2012,31(17):2175-2186.

[15]MARINONI I,KURRER A S,VASSELLA E,et al.Loss of DAXX and ATRX are associated with chromosome instability and reduced survival of patients with pancreatic neuroendocrine tumors [J].Gastroenterology,2014,146(2):453.