李巧轉(zhuǎn),李 嫻

(1.解放軍第101醫(yī)院病理科,江蘇無錫 214044；2.重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室 400016)

膠質(zhì)瘤是十分常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，惡性度高，患者生存率低。程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)是免疫球蛋白家族的一種膜蛋白，在繼發(fā)感染中對免疫介導(dǎo)的組織損傷有重要的保護(hù)作用，它包含程序性死亡-配體1(PD-L1)和程序性死亡-配體2(PD-L2)兩種抑制性配體。研究表明，PD-L1在非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、腎細(xì)胞癌等眾多腫瘤高表達(dá)[1-3]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法觀察PD-1/PD-L1在人膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理特征相關(guān)性。TUNEL法檢測膠質(zhì)瘤內(nèi)浸潤性淋巴細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)分析PD-L1促進(jìn)膠質(zhì)瘤患者外周血中活化T細(xì)胞的凋亡情況，為膠質(zhì)瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 正常腦組織18例選自腦外傷腦出血患者，膠質(zhì)瘤組織80例均取自解放軍第101醫(yī)院病理科2007-2011年的病理標(biāo)本，術(shù)前未經(jīng)化療、放療與激素治療，病理診斷明確且有完整的臨床病理資料，均取得知情同意。其中男45例，女35例，年齡6～75歲，平均(47.5±5.4)歲。根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分型(2011年版)進(jìn)行分級，Ⅰ級3例，Ⅱ級24例，Ⅲ級20例，Ⅳ級33例。病例資料的隨訪通過電話和戶籍查訪兩種方法進(jìn)行，隨訪時(shí)間大于或等于60個(gè)月，隨訪成功54例(67.5%)。膠質(zhì)瘤患者外周血選取術(shù)后確診在院的膠質(zhì)瘤Ⅳ級患者(因Ⅳ級患者PD-L1的表達(dá)率高)，均取得患者及家屬同意。

1.2方法

1.2.1試劑 一抗PD-1(克隆號UMAB199)，PD-L1(克隆號UMAB228)，PD-L2(克隆號UMAB223),CD3(克隆號UMAB54)和二抗檢測試劑PV8000均購自無錫傲銳東源生物科技有限公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)方法 采用的10%中性甲醛固定石蠟包埋組織，4 μm脫蠟水化組織切片，熱修復(fù)后磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，放置H2O2中孵育15 min，滴加一抗孵育過夜(4 ℃)，二抗室溫孵育30 min后經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：(1)首先用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，PD-L1、PD-1主要定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，陽性染色為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或者褐色顆粒，呈彌漫性分布；(2)在400倍視野下，避開出血和壞死區(qū)域，選取具有代表性的腫瘤區(qū)域，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)500～1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)病例的腫瘤細(xì)胞陽性率；(3)腫瘤細(xì)胞陽性率評分：<1%為0分；1%～<10%為1分；10%～<50%為2分；50%～<75%為3分；≥75%為4分；(4)同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行記分：無染色0分；淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；(5)最后根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性率和染色程度進(jìn)行評分相加：0～3分為低表達(dá)，4～7分為高表達(dá)。

1.2.3TUNEL法檢測淋巴細(xì)胞凋亡 切片脫蠟并經(jīng)抗原修復(fù)及PBS洗滌后H2O2中孵育20 min，清洗后滴加50 μL末端脫氧核糖酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)反應(yīng)液常溫孵育1 h，洗滌后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)遮光孵育25 min，DAB顯色蘇木素復(fù)染封片，陰性對照以PBS代替TdT。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞凋亡 分別收集5例健康和膠質(zhì)瘤Ⅳ級患者的抗凝新鮮外周血，梯度離心提取單個(gè)核細(xì)胞后經(jīng)尼龍毛獲得T淋巴細(xì)胞。經(jīng)過聚羥基脂肪酸酯(PHA)活化的T細(xì)胞接種于24孔板，每孔500 μL×106個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后分為空白組(加入PBS)、拮抗組(抗PD-1+ PD-L1)和實(shí)驗(yàn)組(加PD-L1)共培養(yǎng)48 h，收集T細(xì)胞，經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)檢測PD-L1在膠質(zhì)瘤組織中蛋白表達(dá) 結(jié)果顯示：PD-L1主要定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色著色PD-L1在人正常膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)，在部分膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)42.50%(34/80)，見圖1。

A:正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)PD-L1;B:膠質(zhì)瘤低表達(dá)PD-L1;C:膠質(zhì)瘤高表達(dá)PD-L1

圖1免疫組織化學(xué)檢測PD-L1在正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤組織的低表達(dá)及高表達(dá)(×200)

2.2PD-L1與膠質(zhì)瘤臨床病理因素之間的相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)對膠質(zhì)瘤PD-L1的表達(dá)與腫瘤位置、大小、有無壞死及臨床病理分期及年齡等進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，病理分級越高，PD-L1的表達(dá)水平越高(P<0.01)；PD-L1表達(dá)與和膠質(zhì)瘤分級相關(guān)的壞死有關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤位置、大小無關(guān)，見表1、2。

表1 PD-L1在80例膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)與臨床病理特征(n)

表2 80例膠質(zhì)瘤患者在不同影響因素下PD-L1表達(dá)可信區(qū)間分析

2.3PD-L1的表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系 按照材料與方法中的分類說明，將PD-L1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)分為低表達(dá)組(評分0～3分)和高表達(dá)組(評分4～7分)。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)：PD-L1低表達(dá)組患者5年生存率明顯高于PD-L1高表達(dá)組的患者(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 54例膠質(zhì)瘤隨訪成功患者PD-L1表達(dá)5年生存率

圖2 PD-L1在膠質(zhì)瘤組織中Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果

2.4膠質(zhì)瘤局部浸潤的淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1并出現(xiàn)凋亡 免疫組織化學(xué)染色顯示膠質(zhì)瘤Ⅳ級瘤組織內(nèi)浸潤的部分淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1。TUNEL法檢測結(jié)果顯示PD-L1強(qiáng)陽性的病例中膠質(zhì)瘤組織內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，然而PD-L1陰性的膠質(zhì)瘤病例瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)少，見圖3。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測膠質(zhì)瘤Ⅳ級局部浸潤淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡(TUNEL×200)

圖4 PD-L1對外周血活化T細(xì)胞凋亡的影響

2.5PD-L1對患者外周血活化T細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞結(jié)果顯示重組人PD-L1與健康或膠質(zhì)瘤患者外周血活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)后，重組人PD-L1組的凋亡率為42.55%，明顯高于空白對照組，加入抗PD-1阻斷PD-L1與T淋巴細(xì)胞結(jié)合后，PD-L1+抗PD-1組T淋巴細(xì)胞凋亡率下降至26.80%，見圖4。

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差，迄今為止，膠質(zhì)瘤局部微環(huán)境調(diào)節(jié)其侵襲性、增殖、凋亡等生物學(xué)異常行為的具體分子機(jī)制仍不清楚[4]。因此，闡明惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子機(jī)制，對膠質(zhì)瘤的治療及其預(yù)后有著重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)PD-L1可以獨(dú)立作為胰腺癌患者預(yù)后評價(jià)的指標(biāo)；同時(shí)在胃癌患者，高表達(dá)PD-L1患者臨床分期晚，病理分化差[5-6]，PD-L1高表達(dá)病例其腫瘤擴(kuò)散指數(shù)ki-67表達(dá)也上調(diào)，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中運(yùn)用阻斷劑下調(diào)PD-L1后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)也程相對靜止?fàn)顟B(tài)[7-8]。在非小細(xì)胞肺癌中，PD-L1在腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)與淋巴細(xì)胞表達(dá)成正相關(guān)，也與臨床分期及預(yù)后呈正相關(guān)[9]。這都提示阻斷PD-L1可能是腫瘤免疫治療的有效手段。本研究檢測了80例膠質(zhì)瘤石蠟切片中PD-L1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤各級別之間PD-L1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PD-L1的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級別的增高而增高，進(jìn)一步的隨訪顯示膠質(zhì)瘤高表達(dá)PD-L1的患者5年生存率較低[10-11]。

在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的生發(fā)中心。T細(xì)胞在靜息狀態(tài)下低表達(dá)PD-1，而T細(xì)胞的激活引起PD-1的表達(dá)上調(diào)。本研究表明膠質(zhì)瘤中浸潤性淋巴細(xì)胞部分表達(dá)PD-1，同時(shí)TNUEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高表達(dá)PD-L1組膠質(zhì)瘤內(nèi)浸潤性淋巴細(xì)胞凋亡明顯，流式細(xì)胞結(jié)果也顯示PD-L1+抗PD-1組T細(xì)胞的凋亡率明顯下降，PD-L1蛋白促進(jìn)膠質(zhì)瘤外周血活化T細(xì)胞的凋亡，這提示了膠質(zhì)瘤高表達(dá)的PD-L1與淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD-1結(jié)合促進(jìn)淋巴細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制抗腫瘤免疫功能。這可能與T細(xì)胞跨膜受體PD-1與配體PD-L1結(jié)合后，其碳端結(jié)構(gòu)域磷酸化繼而去磷酸化其下游因子磷脂酰3激酶和脾酪氨酸激酶，進(jìn)而抑制T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[12-13]有關(guān)。

綜上所述，人膠質(zhì)瘤組織異常高表達(dá)PD-L1，且與病理分級和患者預(yù)后密切相關(guān)，PD-L1與PD-1結(jié)合促進(jìn)腫瘤內(nèi)浸潤的T淋巴細(xì)胞的凋亡，因此PD-1/ PD-L1信號通路有望成為膠質(zhì)瘤免疫治療的靶點(diǎn)之一。

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