劉享享，蘭文軍

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院， 濟(jì)南 250353)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將靈敏度較高的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和特異性結(jié)合較強(qiáng)的免疫反應(yīng)相聯(lián)合產(chǎn)生的一種分析方法，其最初的理論基礎(chǔ)來源是放射免疫分析[1]?；瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)其本身具有熒光的特征，在無激發(fā)光存在的情況下仍可以產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而避免了熒光收集時(shí)激發(fā)光中散射光的影響。除了具有高特異性、高靈敏度以及寬線性檢測(cè)范圍的顯著優(yōu)點(diǎn)外，化學(xué)發(fā)光免疫分析所需要的檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單、操作方法方便、不具有放射性污染且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,節(jié)省時(shí)間等一系列的優(yōu)勢(shì)[2-6]，逐漸得到各科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注和研究應(yīng)用，尤其是在調(diào)味食品原料安全的快速檢測(cè)中得到越來越多的應(yīng)用。

1 化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理

化學(xué)發(fā)光免疫分析，是將免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合而產(chǎn)生的[7]。免疫反應(yīng)部分主要是抗原或抗體與報(bào)道標(biāo)記物結(jié)合后，通過特異性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗原-抗體復(fù)合物的過程?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)指報(bào)道標(biāo)記物與相關(guān)催化劑的反應(yīng),首先形成一個(gè)中間物質(zhì)，處于一種激發(fā)態(tài),從激發(fā)態(tài)到達(dá)基態(tài)的中間物質(zhì)會(huì)釋放出一系列光子或電子，最后通過專門的信號(hào)收集儀器計(jì)算出光量子的產(chǎn)出率[8]。

2 化學(xué)發(fā)光免疫分析方法分類

化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類標(biāo)準(zhǔn)存在著較大的差異，目前主要依據(jù)各種方法本身借助的報(bào)道標(biāo)記物質(zhì)的差異，分為采用具有發(fā)光能力的化學(xué)發(fā)光劑對(duì)抗原或抗體直接進(jìn)行標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析(直接法)；另一類是將化學(xué)發(fā)光劑作為酶促反應(yīng)底物的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析；以及在電極表面進(jìn)行的電子得失的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)稱為電化學(xué)發(fā)光免疫分析。

2.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析(直接法)

化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescent Immunoassay,CLIA)又稱為直接法檢測(cè)，利用具有發(fā)光功能的化學(xué)類物質(zhì)和抗原或抗體直接反應(yīng)，隨后在一系列的生理生化反應(yīng)中達(dá)到檢測(cè)目的的免疫分析方法。常見的報(bào)道標(biāo)記物有吖啶脂，但吖啶脂由于熱穩(wěn)定性不好，目前常用吖啶脂衍生物作為報(bào)道標(biāo)記物。吖啶脂衍生物具有發(fā)光能力的技術(shù)原理為：在含H2O2的堿性溶液中，吖啶脂衍生物作為報(bào)道標(biāo)記物發(fā)生由激發(fā)態(tài)到基態(tài)的轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生一定的光子而被檢測(cè)器捕獲。吖啶脂衍生物標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光系統(tǒng)簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快，無需催化劑的加入，且標(biāo)記效率高，本底低，但此類閃光型化學(xué)發(fā)光對(duì)儀器要求較高。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA)是在酶類物質(zhì)作為報(bào)道標(biāo)記物的情況下，與加入的抗原或抗體產(chǎn)生帶有酶標(biāo)記的復(fù)合物，然后與底物反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，在專門儀器中收集發(fā)光信號(hào)。辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)是目前使用比較普遍的標(biāo)記酶，它們具有各自特定的發(fā)光底物。

魯米諾及其衍生物作為HRP的主要發(fā)光底物，利用HRP與抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物，將魯米諾或其衍生物質(zhì)在堿性環(huán)境H2O2參與下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生光子，其中HRP的量也影響信號(hào)強(qiáng)度。金茂俊等[9]認(rèn)為此傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光體系為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，產(chǎn)生的光強(qiáng)度相對(duì)較小，從而會(huì)導(dǎo)致測(cè)量時(shí)難度大，如果加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑可顯著提高發(fā)光信號(hào),穩(wěn)定發(fā)光的時(shí)間明顯延長(zhǎng),從而增強(qiáng)此反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏性和準(zhǔn)確度。1，2-二氧環(huán)己烷作為目前ALP的發(fā)光底物，應(yīng)用較為普遍。Bronstein等[10]發(fā)現(xiàn)的3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(AMPPD)-ALP發(fā)光體系是該化學(xué)發(fā)光體系中主要選擇的體系。這一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系的特點(diǎn)是反應(yīng)速度快，發(fā)光時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)儀器要求稍低，短時(shí)間可提供檢測(cè)結(jié)果。

2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析

電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)與免疫分析方法相互融合而產(chǎn)生的一類更加方便、快捷的檢測(cè)分析方法稱為電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(Electrochemiluminescent Immunoassay,ECLIA)。該方法是通過電極表面所產(chǎn)生的電子的得失而發(fā)生的一系列反應(yīng)，而其他化學(xué)發(fā)光是通過化合物之間彼此作用激發(fā)發(fā)光反應(yīng)的進(jìn)行。三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)32+]為電化學(xué)發(fā)光免疫分析常用的發(fā)光底物,主要通過三丙胺(TPA)的激發(fā)促使發(fā)光反應(yīng)的產(chǎn)生。Ru(byp)32+和TPA在陽極同時(shí)失去電子，發(fā)生氧化反應(yīng)。其基本原理為：二價(jià)的[Ru(byp)32+]被氧化成三價(jià)的[Ru(byp)33+]，同時(shí)TPA也被氧化成了陽離子自由基(TPA+*)，TPA+*通過自身質(zhì)子的釋放變成了不穩(wěn)定的TPA*，并將一個(gè)電子傳遞給三價(jià)的[Ru(byp)33+]而使之變成激發(fā)態(tài)的二價(jià)[Ru(byp)32+*]；二價(jià)的[Ru(byp)32+*]衰減釋放出光子，再次回到基態(tài)形式的[Ru(byp)32+]。通過這種方式可以在短時(shí)間內(nèi)發(fā)出穩(wěn)定的光，且在電極表面反復(fù)進(jìn)行，發(fā)光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。

3 化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)在調(diào)味食品原料安全檢測(cè)中的應(yīng)用

中國(guó)對(duì)于調(diào)味食品的探索和食用有著悠久的歷史，可以說調(diào)味食品在我們的日常生活中起著重要的使用價(jià)值。伴隨著化工合成添加物質(zhì)在食品中的發(fā)展，調(diào)味品生產(chǎn)行業(yè)也蓬勃發(fā)展。但是，調(diào)味食品在快速發(fā)展的同時(shí)，也存在著不少問題，尤其是原料安全檢測(cè)方面。比如，釀造類和鮮菜類調(diào)味品中原料的農(nóng)藥殘留，水產(chǎn)類調(diào)味品中抗生素的不當(dāng)使用等，嚴(yán)重?fù)p害著消費(fèi)者的利益和身體健康。因此，選用快速、高效的檢測(cè)技術(shù)是至關(guān)重要的。

3.1 調(diào)味食品原料中藥物殘留檢測(cè)

調(diào)味食品中的藥物殘留最主要的原因是在原料加工時(shí)未進(jìn)行嚴(yán)格有效的把控，從而產(chǎn)生一系列的食品安全問題，所以對(duì)于調(diào)味食品原料的檢測(cè)尤為重要。傳統(tǒng)調(diào)味食品原料中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有色譜、質(zhì)譜以及高效液相等，但是操作步驟復(fù)雜，儀器昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求也很高。而化學(xué)發(fā)光免疫分析操作步驟簡(jiǎn)單、性價(jià)比高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)其他檢測(cè)方法的不足。

食醋是一種酸味調(diào)味品，隨著工藝的不斷改進(jìn)，飲料型食醋是目前比較受消費(fèi)者歡迎的產(chǎn)品。而對(duì)于原料(如各種水果以及水源)的監(jiān)控也是重中之重。2017年，Ding等[11]將化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食醋原料蘋果和梨中煙堿類農(nóng)藥氯噻啉的快速檢測(cè)，其線性范圍為0.13～5.84 ng/mL，半定量檢測(cè)抑制中濃度(IC50)為0.86 ng/mL。與建立的噬菌體酶聯(lián)免疫分析方法相比，其方法檢測(cè)的線性范圍更寬，靈敏度更高，與高效液相色譜結(jié)果顯示良好的相關(guān)性。2012年，Jin等[12]利用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法實(shí)現(xiàn)了環(huán)境中三唑磷農(nóng)藥的檢測(cè),檢測(cè)范圍為0.04～5 ng/mL,對(duì)水和土壤的添加回收率分別為117.2%和122.0%。

在一些風(fēng)味飲品中也需要一些調(diào)味食品，從而起到提升口感的作用。比如奶精可以使飲品口感更加順滑，奶精的原料可以從動(dòng)物乳制品濃縮而成，而這些原料中殘存的獸藥可以危害到消費(fèi)者的身心健康。隨著化學(xué)發(fā)光免疫分析方法高靈敏、可多種藥物同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)顯現(xiàn),一些奶制品獸藥的檢測(cè)也得到進(jìn)一步拓展和深化。Luo等[13]利用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，在2016年成功檢測(cè)出牛奶中新霉素的含量，最低檢測(cè)限為9.4 μg/kg，靈敏度為2.4 ng/mL，其中添加樣標(biāo)本平均回收率為88.5%～105.4%，與液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行比較具有較高的相關(guān)系數(shù)。2014年，Tao等[14]基于化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了牛奶中氯霉素和鹽酸克侖特羅的雙重檢測(cè)，牛奶樣品中氯霉素和鹽酸克侖特羅的靈敏度分別為0.00501，0.0128 μg/L，結(jié)果明顯優(yōu)于商業(yè)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

3.2 調(diào)味食品原料中違禁添加物檢測(cè)

除藥物殘留外，調(diào)味食品原料中還含有一些危害人體健康的添加物，如俗稱“瘦肉精”的鹽酸克侖特羅，主要作為飼料中常用的調(diào)味劑。消費(fèi)者食用了殘留瘦肉精的肉就有可能產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)比如頭疼、四肢麻木、心悸等。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在克倫特羅、沙丁胺醇、嗎啡等違禁添加物檢測(cè)中表現(xiàn)出較高的靈敏度，該方法的應(yīng)用價(jià)值也將會(huì)得到顯著提升。

2013年，Yao等[15]基于電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，建立了克倫特羅的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為0.02 ng/mL，線性檢測(cè)范圍為0.05～1000 ng/mL。2015年，Cai等[16]利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，建立了沙丁胺醇的免疫分析檢測(cè)，檢測(cè)線性變化范圍為0.05～500 ng/mL，檢測(cè)下限為0.017 ng/mL。2012年，杜海平[17]建立了金磁微粒和化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合的嗎啡的免疫檢測(cè)方法，結(jié)果顯示IC50為63 ng/mL。此方法可以快速地檢測(cè)食品中是否含有違禁調(diào)味食品罌粟殼。

3.3 調(diào)味食品原料中生物毒素的檢測(cè)

調(diào)味食品原料中天然存在的毒素以及一些毒素的次級(jí)代謝產(chǎn)物，比如含有生物毒素的豆類或水稻等被加工成調(diào)味食品后，嚴(yán)重影響人體健康。為了更加安全、快捷、方便、有效地檢測(cè)調(diào)味食品原料中的生物毒素，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)。米酒的釀造過程中，霉變水稻中生物毒素的檢測(cè)至關(guān)重要。2013年，Yu等[18]建立了黃曲霉毒素B1的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，該方法線性范圍為0.003～0.03 ng/mL，檢測(cè)限為0.0015 ng/mL，對(duì)水稻和綠豆的添加回收率分別為90%～104%和102%～117%。2015年，Kim等[19]基于化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，建立了水稻中赭曲霉素A的檢測(cè)方法，檢測(cè)效果比酶聯(lián)免疫分析方法高7.3倍。

為了更好地節(jié)省時(shí)間以及化學(xué)試劑，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可實(shí)現(xiàn)多種生物毒素的同時(shí)檢測(cè)，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測(cè)暫時(shí)是無法實(shí)現(xiàn)的。2016年，Wang等[20]基于硅膠-水凝膠光子晶體微球技術(shù)，建立了黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B2和赭曲霉毒素A多重真菌毒素的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測(cè)方法，3種毒素的線性檢測(cè)范圍分別為0.0001～1，0.001～10，0.0001～1 ng/mL，在水稻、玉米和小麥中的回收率分別為(74.96±5.82)%～(104.87±5.77)%。

3.4 調(diào)味食品原料中病原微生物檢測(cè)

病原微生物的存在可以引起調(diào)味食品原料的霉變和腐敗，進(jìn)而對(duì)人體的健康產(chǎn)生影響，現(xiàn)階段檢測(cè)病原微生物的方法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、方法繁瑣、需要大量的手工操作等不足，而化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可以起到對(duì)以上不足之處的彌補(bǔ)。目前，基于化學(xué)發(fā)光免疫分析方法, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度和檢測(cè)靈敏度, 可顯著降低檢測(cè)時(shí)間, 因此，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在調(diào)味食品原料病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域存在必然的發(fā)展趨勢(shì)。2008年，Wolter等[21]利用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，建立了水樣中大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌和嗜肺軍團(tuán)菌的免疫檢測(cè)，這3種菌的檢測(cè)限分別為3×103,3×106，1×105個(gè)/mL。2006年，郭小英等[22]基于化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法建立了大腸桿菌的檢測(cè)方法，與人工計(jì)數(shù)培養(yǎng)檢測(cè)相比，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9807,這對(duì)于調(diào)味食品原料中大腸桿菌污染的快速檢測(cè)是非常有必要的。

4 展望

近年來，食品安全事件不斷出現(xiàn)，而調(diào)味食品又是日常生活中不能缺少的，調(diào)味食品安全問題也越來越受到人們的關(guān)注。因此，建立統(tǒng)一的調(diào)味食品原料安全檢測(cè)體系，對(duì)于調(diào)味食品原料快速統(tǒng)一的檢測(cè)方法和完善的質(zhì)量控制措施是當(dāng)務(wù)之急的工作。

由于化學(xué)發(fā)光免疫分析較強(qiáng)的檢測(cè)專一性、較高的靈敏度、儀器使用和操作相對(duì)簡(jiǎn)單、可同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),在調(diào)味食品原料安全檢測(cè)方面得到了良好的應(yīng)用。目前對(duì)于該方法的應(yīng)用主要還是在抗原、抗體和半抗原的免疫測(cè)定中,這勢(shì)必在調(diào)味食品原料安全檢測(cè)領(lǐng)域中提供一種超痕量的免疫檢測(cè)手段?？傮w而言，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法相比，該方法檢測(cè)靈敏度更高，對(duì)于分子量較小的化合物也能進(jìn)行檢測(cè)，并且可以實(shí)現(xiàn)多種有害物質(zhì)的殘留檢測(cè)，而傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析在進(jìn)行多種成分檢測(cè)時(shí)較困難。但是，金茂俊等發(fā)現(xiàn)目前的化學(xué)標(biāo)記物發(fā)光值尚不十分穩(wěn)定，從而造成批內(nèi)批間的變異系數(shù)會(huì)高于酶聯(lián)免疫分析方法[23]。所以，化學(xué)發(fā)光免疫分析依然存在一些在試驗(yàn)中亟待解決的困擾，比如(1)尋找更多更加穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；(2)對(duì)目前使用較多的標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性的改進(jìn)和改造；(3)探索與其他新型技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)快速有效的檢測(cè)，節(jié)約時(shí)間成本；(4)如何提高電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的應(yīng)用穩(wěn)定性。隨著科技的不斷發(fā)展，相信在不久的將來化學(xué)發(fā)光免疫分析方法一定能在調(diào)味食品原料安全檢測(cè)中不斷展現(xiàn)其優(yōu)越性。

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