陳艷敏 黃江浩 劉平 於艷霞 韋淑嫻 葉佐婉

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院，廣東 深圳 518104)

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一[1],目前肺癌病死率約是40年前的10倍,已成為病死率最高的腫瘤疾病[2]，肺癌每年約160萬新增病例、130萬死亡病例[3]。肺癌的早期診斷是提高患者治愈率和降低病死率的關(guān)鍵，大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在動物、植物及病毒中廣泛存在，并且參加了細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等多項生命活動[4，5],隨著人們對微小RNA研究的深入，已有大量文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA基因作為腫瘤標(biāo)志物可作肺癌診斷,腫瘤標(biāo)志物對肺癌的早期診斷以及療效判斷與監(jiān)測有一定的臨床意義]。血清中miR-126-5p是體內(nèi)重要的微小RNA基因，研究發(fā)現(xiàn)，miR-126對于心血管系統(tǒng)特異性最高，對于胚胎組織、呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等也有較高特異性[6]，Shen等[7]鑒定出了在早期非小細(xì)胞肺癌中異常表達(dá)的12種miRNAs，其中miR-21、 miR-126、miR-210、miR-486-5p用于區(qū)分NSCLC患者與健康者的的敏感性及特異性分別為86%、97%，其肺癌患者血清中高表達(dá)及較高的靈敏度和特異度的特點對肺癌診斷有較大臨床價值,可作為肺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 本文資料為55例肺癌患者組和包括21例健康對照者及32例肺部良性疾病患者的非肺癌組。本項目完成的前提是收集到大規(guī)模的合格標(biāo)本，在病人知情同意下，我們在本院和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所收集標(biāo)本，挑選未經(jīng)治療且處于疾病I/II期的新發(fā)病例，經(jīng)病理學(xué)確診的肺癌患者為肺癌組，病人入選標(biāo)準(zhǔn)包括疾病局限于胸部，沒有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的證據(jù)，排除高血壓、心血管疾病及糖尿病疾患。 ①肺癌組患者55例，男性31例，女性24例，平均年齡60.71歲，中位數(shù)60歲。②非肺癌組患者53例，男性24例，女性29例，平均年齡57歲，中位數(shù)53歲。非肺癌組中包括健康對照者(A亞組)21例和(B亞組)中的32例肺部其他疾病患者(肺部感染、結(jié)核性胸膜炎、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病、矽肺等)。標(biāo)本采集前一年內(nèi)沒有外科手術(shù)史和放射治療史，病例至少跟蹤隨訪兩年。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有受檢對象均于早晨6：00～9：00空腹用EDTA抗凝管靜脈采血5 ml并混勻抗凝，30min內(nèi)于4 ℃，3000 r/min離心10 min分離血清，上層血漿分裝至 1.0 ml冷凍管,每管0.5 ml,置-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA提取用miReasy Mini Kit試劑(Qiagen德國)提取血漿中的miRNA。主要步驟如下：①向400 ul血漿中加入5倍體積的QIAzol試劑，室溫放置5 min。②加入等體積100 %氯仿，放置2～3 min。③4 ℃、12000 r/min離心15 min后將離心機(jī)調(diào)至室溫。④ 取上層水相300 ul，加入1.5倍體積100 %乙醇，充分混勻。⑤將混合液依次轉(zhuǎn)移至RNeasy Mini spin column柱子中，12000 r/min室溫下離心15 s，棄廢液。⑥加700 ul Buffer RWT，離心 (同上)，棄廢液。⑦加500 ul RPE，離心 (同上)，棄廢液。⑧重復(fù)步驟7。⑨換新2ml 收集管，空轉(zhuǎn)2min。⑩用30ul的RNease-free water溶解RNA。置于-70℃低溫冰箱備用。為將RNA提取效率及PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,在每個提取標(biāo)本中加入25飛摩爾的合成線蟲miR-54(Cel-miR-54)。

1.2.3 RT-qPCR檢測 應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit 試劑(Qiagen德國，part No：4440044)于普通PCR儀(上海宏石 SLAN-96P)上進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。由于血清中miRNA的濃度較低，按照試劑盒說明書，取15 ul模板RNA+4 ul Buffer RT+1 ul Mix，反應(yīng)體系為20 ul，反應(yīng)條件為：37 ℃、1 h，95 ℃、5 min。qPCR(美國ABI step one plus)反應(yīng)采用miScript SYBR Green PCR Kit 試劑盒(Qiagen，德國,lot No：1507052)，按照試劑盒說明書依次加入反應(yīng)所需的cDNA模板和試劑:①1ul cDNA+0.4ulmiRNA特異性引物+10ul Mix+2ul UP+6.6ul H2O；②1ul cDNA+0.4ul U6F/R+10ul Mix+8.2ul H2O。反應(yīng)體系均為20ul。反應(yīng)條件為：95℃、15min，94℃、30s，55℃、15s，70℃、30s，設(shè)置2個重復(fù)孔，40個循環(huán)結(jié)束。反應(yīng)在qPCR儀上進(jìn)行(ABI step one plus)。

1.2.4 分析定量PCR數(shù) 應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測肺癌血漿中miR-126-5p的表達(dá)水平。miR-126-5p為目的基因，miR-Cel-54作為內(nèi)參基因作數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。目的基因的相對表達(dá)量(Re)應(yīng)用2-△CT公式進(jìn)行計算，△CTc=CTc目-CTc內(nèi)，△CTn=CTn目-CTn內(nèi)。對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行對數(shù)處理后(log2Re=-△CT)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析miR-126-5p在組間的分布差異。P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異。采用ROC曲線分析指標(biāo)的診斷靈敏度和特異性，通過檢測結(jié)果作圖繪成ROC曲線。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與非肺癌組血清miR-126-5p檢測結(jié)果比較 肺癌組樣本檢驗的均值(△CT)為-1.30，標(biāo)準(zhǔn)差為2.18；非肺癌組樣本檢驗的均值(△CT)為1.17，標(biāo)準(zhǔn)差為4.08。兩組間的-△△CT為2.48。miR-126-5p在肺癌組的含量是非肺癌組的倍數(shù)FC為5.57，F(xiàn)C>1，見表1。

表1 肺癌組與非肺癌組血清miR-126-5p檢測結(jié)果比較Table 1 The serum miR-126-5p

注：-ΔΔCT=ΔCTGROUPN-ΔCTGROUPC

2.2 miR-3405p腫瘤標(biāo)志物在各組血清中的表達(dá)及相關(guān)統(tǒng)計學(xué)指標(biāo) 方差方程的Levene檢驗及均值方程的t檢驗均顯示，miR-126-5p在肺癌組與非肺癌組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔(F=14.81P<0.001)，(t=-3.91P<0.001)〕；方差方程的Levene檢驗和均值方程的t檢驗均顯示，miR-126-5p在非肺癌組中的健康人(A亞組)和肺部良性疾病(B亞組)之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義〔(F=1.12P>0.05),(t=-1.314P>0.05)〕，見表2。

表2miR-126-5p腫瘤標(biāo)志物在各組血清中的表達(dá)及相關(guān)統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)

Table2miR-126-5pserumtumormarkersandtherelatedstatisticalindicators

組別相關(guān)統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)FPtdfP(雙側(cè))肺癌組與非肺癌組14810?3917890A亞組與B亞組 1120097?131476080106

2.3 miR-126-5p的相對表達(dá)量、靈敏度、特異度在肺癌中的診斷價值 用ROC曲線來評價miR-126-5p的相對表達(dá)量在肺癌的診斷價值，相對表達(dá)量曲線下面積AUC為0.666，漸近 95% 置信區(qū)間為0.563～0.768，漸進(jìn)Sig.b為0，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，表明診斷價值較高(見表3圖1)；miR-126-5p對肺癌診斷的靈敏度為66.1 %，特異度為71.7 %，診斷臨界值為12.25。

表3miR-126-5p的相對表達(dá)量、靈敏度、特異度在肺癌的診斷價值評價

Table3Thesensitivity,relativeexpressionofspecificevaluationofmiR-126-5pinthediagnosticvalueoflungcancer

指標(biāo)ROC曲線下面積漸近95%區(qū)間靈敏度(x10?2)特異度(x10?2)miR?126?5p06660563～0768661717

圖1 miR-126-5pROC曲線圖Figure 1 miR-126-5 proc plot

2.4 肺癌組與非肺癌組的檢測結(jié)果在年齡、性別上均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(P=0.103、P=0.338)。

3 討論

RNA是長度約為19～25bp的非編碼基因的大家族，miRNAs在循環(huán)血液中可穩(wěn)定存在，能夠耐受高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等多種極端條件[8,9]，在基因表達(dá)中起著調(diào)控作用，其表達(dá)量隨腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展而變化，已有研究報道與多種腫瘤疾病相關(guān)，如肺癌[10]、胃癌[11]等。miRNA廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)急反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生命活動過程，作為癌基因或抑癌基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用，Wang XC等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126通過P13k的-AKT途徑對擴(kuò)散的非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，引起凋亡。腫瘤相關(guān)miR在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中穩(wěn)定存在于血液中，有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以調(diào)節(jié)原癌基因和抑癌基因的表達(dá)[13]，在腫瘤研究領(lǐng)域，miRNA已被用于癌癥的分段[14], 有研究表明[15，16，17]，miR-126通過對其靶基因的調(diào)節(jié)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡，參與了腫瘤的發(fā)生、侵龔和轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞的生長發(fā)育、癌變等生命過程中，通過作用多種靶基因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程起著非常重要的作用 ，其在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，可能成為肺癌治療的可選靶點之一。還有研究表明，肺癌等疾病中有miRNA表達(dá)變化[18]，miR-126濃度對非小細(xì)胞肺癌診斷有一定的診斷臨床意義[19]，因而可用于腫瘤疾病的診斷。目前通過miRNA芯片雜交方法許多惡性腫瘤的miRNA表達(dá)譜得以建立，其中一些miRNA成為腫瘤治療的新的靶點并成為臨床患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。miRNA對肺癌疾病的診斷價值，已引起人們的廣泛關(guān)注，目前已報道的miRNA對肺癌的診斷價值不一，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

近幾年,由于各種原因,多種腫瘤發(fā)病率明顯增加,很多腫瘤患者直至疾病晚期才確診,大多數(shù)腫瘤現(xiàn)在仍無有效的治療方法,總體生存率較低[20，21 22]。有研究證實[23，24，]，腫瘤患者血清或血漿游離出的miRNA，成為很有價值的腫瘤檢測指標(biāo)，而且miRNA在血清呈穩(wěn)定狀態(tài)易于被檢測。本研究結(jié)果顯示，miR-126-5p在肺癌患者組的含量是非肺癌患者組的倍數(shù)FC為5.57, 表明其在肺癌患者組是高表達(dá).肺癌患者血清中的miR-126-5p水平明顯高于非肺癌患者，表明miR-126-5p可作為診斷肺癌較為理想的指標(biāo)。miR-126 ROC曲線下面積AUC為0.666,靈敏度，特異性均較高(66.1 %和71.7 %)，表明其對肺癌有中度的診斷能力和較高的排出其他疾病的能力,有望成為新的腫瘤標(biāo)志物.健康對照組與肺良性疾病組血清miR-126-5p水平無差異，表明其對肺部良性病變診斷無臨床意義。肺癌組與非肺癌組的檢測結(jié)果在年齡、性別上均無差別，表明本次實驗肺癌與年齡、性別不存在相關(guān)性，與文獻(xiàn)報道[19]相一致。此研究國內(nèi)外尚無報道，于是我們進(jìn)行了本課題的研究，經(jīng)多方努力，確認(rèn)本研究實驗有較大的臨床價值。

4 結(jié)論

應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)，對血液中miR-126-5p腫瘤標(biāo)志物分析，本實驗提示miR-126-5p對肺癌有一定診斷價值，在肺癌確診尚無理想方案的情況下，miR-126-5p可作為一個參考指標(biāo)，但miR-126-5p在腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用及其靶基因功能尚需深入研究,盡可能標(biāo)化檢測方案和參考范圍，為腫瘤診斷提供新的突破口。

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