劉振華 丁 杰

(貴州省人民醫(yī)院胃腸外科，貴州 貴陽 550002)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，在我國腫瘤中僅次于肺癌、胃癌、肝癌，名列第四位〔1,2〕；其致死率高，我國每年約有20萬人死于結(jié)腸癌〔2〕。目前，消化道腫瘤的診斷主要以內(nèi)鏡檢查聯(lián)合病理診斷為主。因其侵入性，且受內(nèi)鏡醫(yī)師判斷能力、患者配合程度等多因素影響，因此尋找確切的腫瘤標志物以提高結(jié)腸癌早期診斷率具有重要的臨床意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀(circ)RNAs是信使(m)RNA剪接過程中的產(chǎn)物，大量分布于原核和真核細胞生物中，因其分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定保守、形式多樣的特性而豐富了RNA家族的內(nèi)容，使其成為非編碼(nc)RNA研究領(lǐng)域的新星〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)〔4〕，其生物學(xué)功能參與正常生理及疾病、甚至腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這種新型的ncRNA可以由細胞分泌的外泌體進入細胞外環(huán)境，并可以通過非侵入性的方法識別和檢測，如大便、血液和其他體液樣本，為circRNAs可能成為潛在有效的結(jié)腸癌早期篩查分子靶標提供了極大的便利，對提高結(jié)直腸癌早期診斷率及預(yù)測其預(yù)后具有重要意義。因此本文就circRNAs在結(jié)直腸癌研究中的現(xiàn)狀做一綜述。

1 circRNAs概述

1.1circRNAs生成 自從單鏈circRNAs結(jié)構(gòu)在上世紀70年代研究類病毒的過程中首次被發(fā)現(xiàn)以來，隨著生物技術(shù)，尤其是轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及其分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的circRNAs得以發(fā)現(xiàn)〔5～7〕。但circRNAs的產(chǎn)生機制、調(diào)控過程尚未完全清楚，可能受順式調(diào)控元件與反式作用因子調(diào)控，主要包括內(nèi)含子環(huán)化和外顯子環(huán)化兩種途徑，通過“內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化”〔8〕或“外顯子跳讀”〔9〕機制形成，其序列中不僅包含1～2個內(nèi)含子或1～5個外顯子，也含有基因間區(qū)或非編碼區(qū)域〔10〕。根據(jù)circRNAs的序列構(gòu)成主要可分為三類，外顯子來源、 內(nèi)含子來源及由外顯子-內(nèi)含子共同構(gòu)成的circRNAs。目前認為，外顯子來源的circRNAs是在mRNAs前體剪切過程中，外顯子的 5′端與3′端以反向剪切形式形成 3′，5′磷酸二酯鍵，共價閉合形成的，大部分具有microRNA(miRNAs)結(jié)合靶點〔11〕。在人類細胞中存在核內(nèi)circRNAs：環(huán)狀內(nèi)含子RNA(ciRNAs)，其形成可能由于脫支失敗而積累；進一步發(fā)現(xiàn)ciRNAs在核中豐富但不富集miRNAs靶點。敲除ciRNA會導(dǎo)致其親本基因的表達下降；某些ciRNAs能充當(dāng)PoⅢ轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子，對其親本編碼基因發(fā)揮順式調(diào)控作用〔12〕。外顯子-內(nèi)含子circRNAs(EIciRNAs)作為環(huán)狀RNA的亞型，被認為是基因組編碼的調(diào)控元件，而不是不可避免的基因表達噪聲〔12〕。

1.2circRNAs生物學(xué)特征 在大量的非蛋白質(zhì)編碼RNAs家族中，circRNAs是一類新型的小分子RNA，可以作為一類新的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)?，F(xiàn)在已知這種新型的RNA在所有組織中表達，一般表達水平較低，但在真核轉(zhuǎn)錄組中高度表達。據(jù)報道，在不同的動物物種中，circRNAs普遍存在，可能是調(diào)控發(fā)育的基因表達程序組分〔13〕。此外，他們隨后報道了circRNAs的相對豐度以基因和細胞類型特異性方式調(diào)節(jié)，其表達水平與典型線性mRNAs的水平相當(dāng)，并且某些circRNAs可抵抗核糖核酸外切酶的消化作用〔13〕。

在人類細胞中存在多達25 000個不同的circRNAs，雖然大多數(shù)circRNAs在正常組織表達水平較低，但是有些已經(jīng)被證明比它們的線性RNA表達更豐富〔10，13〕。circRNAs的獨特性質(zhì)是它們與其他lncRNAs的結(jié)構(gòu)不同。真核細胞中大多數(shù)circRNAs雖缺少3′poly(A)尾和5′端帽，但均能較穩(wěn)定地分布于細胞質(zhì)中。 Jeck等〔10〕用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)方法對放線菌素D處理過的Hs68細胞驗證了HIPK3，circ HIPK3優(yōu)先位于細胞質(zhì)中，這與先前的circRNAs研究一致。 Guo等〔14〕檢測了circRNAs的亞細胞定位，重點研究了在K562全細胞樣品中檢測到514個circRNAs，發(fā)現(xiàn)這些circRNAs主要存在于多聚A尾消耗的細胞質(zhì)樣品中。顯然，有效轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)的內(nèi)源性circRNAs可能經(jīng)歷核輸出或在有絲分裂過程中釋放至細胞質(zhì)中。研究〔13〕發(fā)現(xiàn)跨越<5個外顯子的大多數(shù)circRNAs具有核糖核酸外切酶抗性。且所有預(yù)測為circRNAs對核糖核酸外切酶具有抗性，而所有預(yù)測的線性序列對核糖核酸外切酶高度敏感。

1.3circRNAs功能 circRNAs在多種類型的癌癥中呈現(xiàn)出異常表達，包括結(jié)直腸癌，肝細胞癌和胰腺導(dǎo)管腺癌；基于circRNAs在癌癥中的功能，circRNAs可作為腫瘤診斷的潛在生物標志物并為癌癥治療提供新的治療靶點〔15〕。目前對于circRNAs的生物學(xué)功能仍未完全清楚，一些可能的功能與自身的環(huán)形結(jié)構(gòu)相關(guān)，發(fā)揮分子“海綿”作用是circRNAs目前相對較明確的重要功能，通過吸附miRNAs形成circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響基因表達〔4，16〕。在人類HeLa細胞和胚胎干細胞hESCs-H9的研究中發(fā)現(xiàn)外顯子-內(nèi)含子circRNAs與聚合酶Ⅱ的延長機制有關(guān)，其作用機制為circRNAs充當(dāng)聚合酶Ⅱ在轉(zhuǎn)錄時的正向調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮順式調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)親本編碼基因轉(zhuǎn)錄〔17,18〕。 circRNAs功能不僅能作為miRNA海綿，而且在某種情況下可以作為反式作用調(diào)節(jié)因子與多種疾病包括結(jié)腸癌在內(nèi)密切相關(guān)。據(jù)推測，circRNAs形成一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，作為miRNA海綿與內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)競爭，直接影響相關(guān)基因的表達〔19〕。 circRNAs可以隔離特定的miRNA復(fù)合物并在切割后釋放它們〔4〕。ciRS-7作為“海綿”吸附miR-7相互作用形成miR-7抑制劑或海綿復(fù)合物可能影響細胞的發(fā)生〔19〕。類似地，睪丸特異性circRNA(Sry)調(diào)節(jié)miR-138的活性〔4〕。因此，ciRS-7和Sry分別與miR-7和miR-138復(fù)合，形成microRNA海綿發(fā)揮阻斷或抑制功能，減少相應(yīng)癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖〔20〕。一項食管鱗狀細胞癌的研究發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3(hsa_circRNA_104170)可結(jié)合8種miRNA(miR-22、miR-136、miR-138、miR-149、miR-433、miR-762、miR-3614-5p 和 miR-3622b-5p)及Foxo3蛋白和Foxo3 mRNA。 circ-Foxo3對這些miRNA具有強化作用，促進Foxo3 mRNA翻譯，抑制腫瘤生長和癌細胞增殖〔21〕。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)上萬種circRNAs具有這種海綿吸附作用，然而目前得到功能驗證的僅是少數(shù)部分〔22〕，近來發(fā)現(xiàn)circRNAs作為腫瘤抗原在調(diào)節(jié)腫瘤免疫和免疫治療中發(fā)揮潛在作用〔23〕。因此關(guān)于circRNAs更多的功能有待進一步探索。

2 circRNAs與結(jié)直腸癌

2.1circRNAs在結(jié)直腸癌中的表達特征 近年來，對circRNAs在腫瘤惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮的作用及機制的深入探索表明circRNAs參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、演變過程。研究發(fā)現(xiàn)〔24〕，在結(jié)直腸癌細胞系和組織中，與正常細胞及組織相比，整個circRNAs表達譜豐度降低，推測可能促進了結(jié)直腸癌細胞的增殖。Bachmayr-Heyda等〔25〕報道結(jié)直腸癌細胞系和腫瘤樣本中的circRNAs豐度與結(jié)直腸癌患者的正常黏膜相比整體減少。與正常結(jié)腸黏膜樣本(78.1%)相比，腫瘤樣本中circRNAs的表達(27.8%)降低。在11個結(jié)直腸癌細胞系中也得到了證明，其表達率甚至更低〔25〕。為了驗證與正常黏膜樣品相比結(jié)直腸癌中減少的circRNAs表達，通過核糖核酸酶消化和隨后的深度測序富集circRNA分析，報道了21 653個不同的circRNAs。最近發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0007534在一組33例結(jié)直腸癌患者的配對樣本中，與癌旁組織相比顯著上調(diào)，且其表達與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；此外，siRNA沉默hsa_circ_0007534顯著抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡〔26〕。這表明circRNAs普遍存在于結(jié)直腸癌組織中并與正?；虬┡越M織表達有顯著差異，被認為是具有潛在診斷和治療意義的理想候選生物標志物。

2.2circRNAs與結(jié)直腸癌腫瘤學(xué)行為的關(guān)系 研究表明，circRNAs與腫瘤的惡性程度、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hou等〔27〕報道了6例腫瘤組織和癌旁正常黏膜配對樣本中，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001988在腫瘤組織中顯著下調(diào)，且腫瘤的分化程度及神經(jīng)周圍浸潤程度與其表達水平具有相關(guān)性。然而，Xie等〔28〕發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中circ_001569的表達水平顯著高于結(jié)直腸癌旁組織，并與結(jié)直腸癌的侵襲性特征相關(guān)，包括遠處轉(zhuǎn)移和分化不良，并發(fā)現(xiàn)miR-145的水平在結(jié)直腸癌組織中顯著降低。同時在四個結(jié)直腸癌細胞系(過表達SW480和HCT116中，并在SW620和LOVO中沉默)中過表達和沉默circ_001569，發(fā)現(xiàn)circ-001569過表達細胞的增殖和侵襲能力增強，而沉默的細胞增殖侵襲能力明顯減弱。此外，使用生物信息學(xué)方法及熒光素酶標記、RT-qPCR和Western印跡分析發(fā)現(xiàn)circ_001569增加了SW480和HCT116細胞中E2F5、BAG4和FMNL2的蛋白質(zhì)水平，SW620和LOVO細胞中的circRNAs有相反作用。Zhu等〔29〕通過circRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)circ-BANP在35個結(jié)直腸癌組織中過表達，通過敲除或干擾circ-BANP可有效抑制結(jié)直腸癌細胞增殖。在結(jié)腸息肉與結(jié)腸癌樣本研究中，發(fā)現(xiàn)circCCD66控制多種病理過程，包括細胞增殖、遷移和侵襲，動物模型中敲低circCCD6可有效抑制腫瘤生長和侵襲〔30〕。另一項研究發(fā)現(xiàn)〔31〕，has_circ_0020397可抑制miR-138發(fā)揮作用，促進結(jié)直腸癌細胞的活性、侵襲并抑制其凋亡，而miR-138具有相反作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)has_circ_0020397抑制結(jié)直腸癌細胞活力、侵襲和促進凋亡可通過促進miR-138靶基因表達來實現(xiàn)〔31〕。肺是結(jié)直腸癌腹外轉(zhuǎn)移最常見部位，研究發(fā)現(xiàn)〔32〕circRNAs在肺轉(zhuǎn)移患者的結(jié)直腸癌組織與無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織相比，表達有差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的circRNAs基因參與DNA修復(fù)，而產(chǎn)生下調(diào)的circRNAs基因富含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中下調(diào)的circRNA基因參與了核因子-κB和Wnt信號通路。此外，證明hsa_circRNA_105055、hsa_circRNA_086376和hsa_circRNA_102761能夠與調(diào)節(jié)miR-7的靶基因PRKCB、EPHA3、BRCA1和ABCC1共同結(jié)合〔32〕。這為解釋結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移提供了新視角。

Zhuo等〔33〕研究6種細胞系與122個結(jié)直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)circRNA0003906表達水平顯著下調(diào)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化差異顯著相關(guān)。研究〔34〕通過實時聚合酶鏈式反應(yīng)對170對配對結(jié)直腸癌樣品進行測定、驗證，發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700表達水平與患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)。研究表明，結(jié)直腸癌中hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700的表達水平顯著低于正常組織。與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中有125個下調(diào)的和76個上調(diào)的RNA。 hsa_circRNA_103809的表達水平與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而hsa_circRNA_104700的表達水平與遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明，hsa_circRNA_103809和hsa_circRNA_104700可能潛在地參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展，并可作為結(jié)直腸癌診斷的潛在生物標志物。另一項研究發(fā)現(xiàn)〔35〕在結(jié)直腸癌組織中hsa_circ_0000069高表達，并且與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)。進行功能分析發(fā)現(xiàn)敲低hsa_circ_0000069能顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞周期的G0/G1期停滯。該研究首次證明了hsa_circ_0000069是結(jié)直腸癌進展中的一個重要調(diào)節(jié)因子，這可能成為結(jié)直腸癌診斷和治療一個潛在靶點。Dou等〔36〕為了研究circRNAs在結(jié)直腸癌進展期的調(diào)節(jié)作用，使用了僅在鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)突變狀態(tài)上不同的3種同基因結(jié)腸癌細胞系。與DKs-8細胞相比，他們發(fā)現(xiàn)DLD-1和DKO-1細胞中的circRNAs整體顯著下調(diào)，表明突變KRAS對circRNAs的豐度產(chǎn)生了影響。這一發(fā)現(xiàn)在兩個獨立的結(jié)腸癌細胞系HCT116(KRAS突變體)和HKe3(KRAS WT)中也得到了證實。在三種細胞系中，circRNAs在分泌的胞外囊泡中也被檢測到，并且circRNAs在外泌體中比在細胞中更豐富。這使得circRNAs作為結(jié)直腸癌潛在的腫瘤標志物通過液體檢測提供了依據(jù)。

2.3circRNAs在結(jié)直腸癌放化療抗性中的作用 術(shù)前5-氟尿嘧啶(5-FU)放化療是局部晚期結(jié)直腸癌的標準治療方法。然而，產(chǎn)生放化療抗性是臨床面臨的重要問題。Xiong等〔37〕通過circRNA芯片技術(shù)闡述了局部晚期結(jié)直腸癌放化療抗性相關(guān)的circRNAs表達譜及調(diào)控機制。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)5種circRNA調(diào)控多種癌癥和癌癥相關(guān)通路，探討結(jié)直腸癌放化療抗性可能的機制，并提出了克服結(jié)直腸癌放化療抗性的潛在靶標。功能富集分析發(fā)現(xiàn)actin-cytoskeleton、focal adhesion及Wnt信號通路均受差異表達的circRNAs調(diào)節(jié)。既往的報道發(fā)現(xiàn)miRNAs在結(jié)腸癌對5-FU的耐藥中發(fā)揮作用〔38〕。因此，circRNAs是否通過調(diào)節(jié)miRNAs參與結(jié)腸癌對化療藥物抵抗或增強敏感性方面有待深入研究。

綜上，circRNAs對腫瘤發(fā)生和發(fā)展有深遠的影響。circRNAs在腫瘤進展中的主要作用可能是通過控制miRNA靶標來調(diào)控癌基因和(或)抑制基因的表達，在腫瘤的發(fā)生和惡性行為中起著重要的作用。然而，關(guān)于結(jié)直腸癌中circRNAs和miRNAs之間正向或負向關(guān)系的分子機制仍知之甚少。circRNA與惡性腫瘤之間的關(guān)系及調(diào)控機制仍需要進一步探索。