王改鳳 申法濤 王偉民

(河南省中醫(yī)院腦病一區(qū)，河南 鄭州 450002)

急性缺血性腦血管病的發(fā)病誘因比較復(fù)雜，大部分研究表明一氧化氮(NO)在缺血性腦損傷中具有重要作用，當(dāng)腦部缺血后一氧化氮合酶(NOS)活性升高，NO過量產(chǎn)生對細(xì)胞有直接毒性作用，進(jìn)而引起腦組織損傷〔1～3〕。三七對腦梗死的治療有一定的效果，但其作用機制尚未被闡明。本研究采用局灶性缺血腦梗死動物模型觀察三七的治療作用及對總一氧化氮合酶(tNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 三七(西安天瑞有限公司)；Trizol (生工生物技術(shù)有限公司)；NgR1及Bax 引物 (生工生物科技有限公司)；tNOS、iNOS 試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)。酶標(biāo)儀，北京瑞利分析儀器公司。PCR儀(Thermo賽默飛世爾科技公司，美國)，電子天平，上海精天電子儀器有公司。

1.2實驗動物 購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物中心，質(zhì)量合格證號：HNASLKJ20150824，SPF級雄性C57BL/6J小鼠40只，體重22～25 g。造模：用10%的水合氯醛麻醉小鼠，仰臥固定，從小鼠的頸部開始切口，隨后將左側(cè)頸總動脈分離并且鈍性分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈，將頸外動脈主干一段結(jié)扎，在頸外動脈游離段上剪一個小口，插入尼龍線栓子，經(jīng)頸總動脈分支處通過頸內(nèi)動脈入顱，至大腦前動脈首端，保持30 min。成模標(biāo)準(zhǔn)：左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失；倒懸時左上肢向胸前屈曲；行走時身體向左轉(zhuǎn)圈或傾倒。隨后將成模小鼠隨機分為模型組與三七高、低劑量組各10只。均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，自由純凈水。給藥方法：三七高、低劑量組中，每只小鼠分別按150、75 mg·kg-1·d-1灌胃三七溶液。模型組和正常組均灌服等體積生理鹽水，連續(xù)10 w。

1.3三七給藥樣品制備 取三七干燥粉900 g，加入500 ml超純水，煎煮2 h，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水煎液濃縮至360 ml，得到三七混懸液，濃度為2.5 g/ml。

1.4血清中tNOS、iNOS檢測 小鼠禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉小鼠后，眼底靜脈叢取血，室溫靜置30 min，分離血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行tNOS、iNOS檢測。

1.5神經(jīng)功能缺陷評分 小鼠手術(shù)后，對其行為進(jìn)行觀察并按照Longa標(biāo)準(zhǔn)評分：正常為0級，無神經(jīng)學(xué)征象；左側(cè)前肢不能完全伸展為Ⅰ級；左側(cè)肢體癱瘓，而且行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象為Ⅱ級；Ⅲ級為大鼠行走向左側(cè)跌倒，或不能站立或打滾；Ⅳ級為無自發(fā)活動，有意識障礙。

1.6腦組織含水量測定 小鼠麻醉處死后，去除額極后取病變側(cè)約2 mm厚的腦組織用于腦含水量測定。先將腦組織稱重，即得濕重(A)。然后用錫紙包裹腦組織，放入 95℃烤箱內(nèi)烘干 24 h 后取出恢復(fù)到室溫，稱重得干重(B)。代入公式計算腦組織含水量：(A-B)/A×100%。

1.7腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的測定 水合氯醛麻醉小鼠后，在再灌注后相應(yīng)時間點斷頭取腦，于冰上分離缺血側(cè)皮層腦組織，在冰浴勻漿器中迅速研磨，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.8實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 將腦組織加入Trizol勻漿，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相層液體小心轉(zhuǎn)移至新的離心管中；然后加入0.5 ml異丙醇，混合均勻，室溫靜置10 min；隨后4℃，12 000 r/min離心10 min，可見少量RNA沉淀；吸棄上清溶液，用75%乙醇洗滌沉淀2次；4℃ 7 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，用DEPC水溶解RNA沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測定RNA純度及濃度；計算總RNA濃度。將溶解后的RNA按說明試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。引物NgR1前向5′ATGCTACAATGAGCCCCAAGG3′，反向5′GAGCTGTGCATTATCGCTGA3′；Bcl-2前向5′GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA3′，反向5′TGCACAGCGGGCATTGGGTTG3′；Bax前向5′TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC3′，反向5′CCAGTGTCCAGCCCATGATG3′；β-actin前向5′CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA3′，反向5′TGAAGCTGTAGCCACGC-TCGGTC3′。擴(kuò)增條件為95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40個循環(huán)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1各組腦缺血72 h后神經(jīng)功能缺陷評分 與正常組〔(5.62±0.46)分〕相比，模型組神經(jīng)損傷評分〔(8.41±0.21)分〕明顯增高(P<0.01)。三七低、高劑量組與模型組比較，神經(jīng)損傷評分〔(6.89±0.29)分，(5.46±0.67)分〕明顯下降，且三七高劑量組下降更明顯(P<0.05 或P<0.05)。

2.2三七對各組腦組織含水量的影響 與正常組(0.58)相比，模型組腦組織含水量增高(0.83,P<0.01)。三七高劑量組(0.79)與模型組比較含水量有所下降(P<0.05)，低劑量組含水量為0.80。

2.3三七對各組腦組織中SOD、MDA的影響 與正常組(81 U/mg,2.8 U/mg)相比，模型組SOD水平(43 U/mg)下降、MDA水平(6.1 U/mg)顯著上升(均P<0.01)。三七低、高劑量組與模型組比較，SOD水平(59、78 U/mg)均明顯上升，其中三七高劑量組上升更顯著(P<0.05，P<0.01)。三七高劑量組(5.0 U/mg)與模型組比較MDA水平顯著下降(P<0.01)，而三七低劑量組(6.2 U/mg)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4三七對各組血清tNOS、iNOS水平的影響 模型組血清tNOS(26 U/mg)、iNOS(16 U/ml)水平較正常組(13、12 U/ml)明顯上升(P<0.01)，三七高、低劑量組血清iNOS(13、16 U/ml)、tNOS(14、16 U/ml)水平與模型組比較顯著下調(diào)(P<0.01或P<0.05)。

2.5三七對各組Bax mRNA水平的調(diào)節(jié) 模型組腦組織Bax mRNA表達(dá)水平(1.8)較正常組明顯上升(0.5，P<0.01)，三七高、低劑量組能顯著下調(diào)Bax mRNA表達(dá)(0.8、1.2，P<0.01)。

2.6三七對各組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié) 模型組腦組織Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(0.6)較正常組明顯下降(1.7，P<0.01)，三七低、高劑量組能顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)(0.8，0.9，P<0.01)。

2.7三七對各組NgR1 mRNA表達(dá)水平的調(diào)節(jié) 模型組腦組織NgR1 mRNA表達(dá)水平(2.2)較正常組明顯上升(0.5，P<0.01)，三七低、高劑量組能顯著下調(diào)NgR1 mRNA表達(dá)(1.6，0.9；P<0.05，P<0.01)。

3 討 論

近年來隨著科學(xué)的進(jìn)步，免疫學(xué)和分子學(xué)科的進(jìn)步，缺血性腦血管病的病理生理研究也取得一定進(jìn)展。NO與神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理過程關(guān)系密切，而且NO在腦中的作用不是單一的，而是雙向可調(diào)節(jié)的，既有腦保護(hù)作用，又有神經(jīng)毒性作用。 有實驗表明，NO在腦中含量低的時候，能夠傳遞生理信息，而當(dāng)其濃度高的時候則具有極強的神經(jīng)毒性〔4〕。 但NO在機體內(nèi)的存在非常不穩(wěn)定，iNOS有催化作用，其作用與NOS的類型有很大的關(guān)聯(lián)性〔5〕。iNOS的激活不依賴鈣離子，當(dāng)它受到內(nèi)毒素及細(xì)胞因子刺激時，iNOS 激活持續(xù)產(chǎn)生大量的 NO，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用〔5～8〕。

Bax主要抑制細(xì)胞凋亡，是Bcl-2家族蛋白之一。有大量研究表明，小鼠體內(nèi)敲除了Bcl-2后，其神經(jīng)元氧化蛋白的水平被顯著上調(diào)，同時會發(fā)生各種氧化應(yīng)激反應(yīng)，這些結(jié)果表明，Bax的過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷，使細(xì)胞抗氧化能力下降；三七可以下調(diào)局灶性缺血腦梗死小鼠Bax RNA表達(dá)〔9～11〕。

本實驗中，三七能顯著下調(diào)tNOS、iNOS在血清中的水平，而且能顯著下調(diào)NgR1及Bax RNA表達(dá)。提示三七對局灶性缺血腦梗死小鼠可能通過下調(diào)tNOS、iNOS，進(jìn)而修復(fù)小鼠腦缺血損傷后的神經(jīng)元。