郭建路 康品方 陶 敏 唐 碧

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科，安徽 蚌埠 233004)

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)-T細(xì)胞活化核因子(NFAT)3在心血管系統(tǒng)表達(dá)豐富,在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1〕,關(guān)于CaN/NFAT3信號通路在心肌損傷過程中作用機制的研究愈發(fā)明確。本文對CaN/NFAT3信號通路與心血管疾病研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CaN

CaN是普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶家族中一員，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶全酶是一種異源二聚體，包含與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的催化亞基CnA(61 kDa)和與Ca2+結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基CnB(19 kDa)。CnA包含N末端的催化區(qū)域，CnB結(jié)合區(qū)域，鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)和C末端自身抑制區(qū)域(AID)。在哺乳動物中，CnA由三個基因編碼，分別為CnAα、CnAβ、CnAγ，但只有CnAα(PPP3CA)和CnAβ(PPP3CB)在哺乳動物心臟中表達(dá)；CnB分別由CnBα和CnBβ編碼，只有CnBα在心臟中表達(dá)〔2〕。CaN參與調(diào)控的信號通路有經(jīng)典的NFATc信號途徑，在CaN的催化下NFATc脫磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子如GATA4共同參與下調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。然而在細(xì)胞核中，CaN則通過抑制輸出蛋白 Crm1與NFATc的結(jié)合〔3〕，使NFATc能夠在核內(nèi)持續(xù)積累而發(fā)揮作用。除了經(jīng)典的NFATc外CaN下游的效應(yīng)分子還有MEF2〔4〕,后者存在于骨骼肌、神經(jīng)及淋巴細(xì)胞中。有研究發(fā)現(xiàn)RTA2作為CaN下游的另一個效應(yīng)分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔5〕。

2 NFATc

NFATc家族是Ca2+/CaN依賴的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括：NFATc1(NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5〔6〕，除了NFAT5的激活依賴于滲透壓改變之外〔7〕，其他成員是最具特異性的CaN下游活化因子，并且其對于CaN功能的發(fā)揮是必不可少的。CaN調(diào)控NFAT蛋白的保守性區(qū)域包含了兩個串聯(lián)結(jié)合域：①調(diào)節(jié)區(qū)域：也叫NFAT異體同形域(NHR)；②DNA結(jié)合域。其中調(diào)節(jié)區(qū)域在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下處于高度磷酸化狀態(tài)，因此NFAT在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)時被限制在細(xì)胞質(zhì)中，不能進(jìn)入細(xì)胞核。NFAT起初是在活化T細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)胞因子表達(dá)的重要誘導(dǎo)因子〔8〕。此后，NFAT蛋白已被證明在免疫細(xì)胞中扮演不同的角色，包括心血管系統(tǒng)〔9〕，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NFAT廣泛分布于各組織。NFATc是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，可轉(zhuǎn)錄諸多細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-12，炎癥細(xì)胞因子與生長因子〔10〕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，分別應(yīng)用CaN 和 NFAT的特異性抑制劑CsA 和A-285222，或應(yīng)用基因干擾技術(shù)使NFAT基因沉默均可有效抑制高糖環(huán)境引起的心血管損傷〔11〕。在心肌纖維化過程中NFAT作為重要的介導(dǎo)信號分子發(fā)揮重要作用〔12〕。

3 Ca2+-CaN-NFATc信號通路的激活

Ca2+/鈣調(diào)素(CaM)-CaN-NFATc 組成鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路。在靜止細(xì)胞中處于高度磷酸化狀態(tài)的NFAT蛋白存在于胞質(zhì)中，對DNA親和力低；NFATc信號通路的激活與游離Ca2+水平升高密切相關(guān)〔13〕，游離Ca2+水平升高，結(jié)合CaM共同作用于CaN A亞基使之活化，CaN使NFAT脫磷酸化激活，活化的NFAT蛋白能在核內(nèi)保持長時間的活化狀態(tài)。處于脫磷酸化狀態(tài)的NFAT蛋白對DNA親和力增高從而促使靶基因轉(zhuǎn)錄。而鈣離子通道的激活離不開磷脂酶(PL)C-γ，活化的PLC-γ作用于二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),使PIP2降解為三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3進(jìn)而激活鈣通道，因此NFATc信號通路的激活與PLC-γ密切相關(guān)。

4 Ca2+-CaN-NFATc4信號通路與心肌肥大

心肌肥大是一種受病理性刺激后的代償性反應(yīng)，以此來保持心臟的收縮性和正常的心臟功能。但是，過度心肌肥大可能導(dǎo)致非適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)和功能的重構(gòu)，進(jìn)而引起諸如心律失常，猝死，甚至心力衰竭。心肌肥大是心力衰竭發(fā)展過程中臨床早期的一個標(biāo)志，并且受多種信號通路調(diào)控。在心肌組織中主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面積和蛋白合成的增加，以及一些胎兒基因的表達(dá)，如β-主要組織相溶性復(fù)合體(MHC)、人心鈉素(ANF)、腦鈉肽(BNP)等〔14〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)CaN/NFATc4 信號通路在心肌肥大過程中發(fā)揮重要作用〔15～17〕。CaN/NFATc4信號通路在內(nèi)皮肽-1誘導(dǎo)的心肌肥大過程中起到肥大性信號作用，當(dāng)NFATc4被CaN脫磷酸化后，即會轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)對β-MHC、ANF、BNP肥大基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控〔14〕。在對重組人小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)2的研究中發(fā)現(xiàn)其在心肌肥大中有重要作用，SUMO2能夠增加NFATc的活化程度，誘導(dǎo)肥大相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞肥大;并且這種現(xiàn)象在離體和在體實驗兩種情況下都能夠出現(xiàn)，可能機制：SUMO2可以通過非依賴性的類泛素化修飾作用與CaN直接發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)后者轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi);同時內(nèi)源性SUMO2可以活化CaN-NFAT信號通路〔18〕。

Guan等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)CD38 基因敲除的細(xì)胞在血管緊張素(Ang)-Ⅱ刺激后，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT1)的磷酸化水平明顯衰弱。在CD38基因被敲除后，Ca2+信號分子cADPR數(shù)量明顯減少，提示CD38在Ca2+/CaN/NFAT 信號通路中扮演重要角色。另外，當(dāng)把H9C2細(xì)胞的CD38基因敲除后，肥大相關(guān)信號AKT的下游效應(yīng)分子GSK-3β的表達(dá)受到抑制。一般情況下GSK-3β處于非磷酸化的活化狀態(tài)，而當(dāng)肥大刺激存在時，GSK-3β第九位氨基酸絲氨酸被磷酸化，隨之處于靜止?fàn)顟B(tài)。GSK-3β的上游調(diào)控通路如：磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT、ERK激酶(MEK)/ERK1/2都可以通過磷酸化GSK-3β的絲氨酸磷酸化位點來調(diào)控GSK-3β的活性〔20〕。當(dāng)使用GSK-3β抑制劑1-Azk或使用siRNA干擾時，使用心肌細(xì)胞肥大性刺激后心肌細(xì)胞表面積有所增加，而當(dāng)GSK-3β激活后，可有效緩解心肌細(xì)胞肥大，說明GSK-3β在心肌細(xì)胞肥大過程中起到保護(hù)性作用。GSK-3β可以通過調(diào)節(jié)NFATc4的N末端保守序列的磷酸化使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)出回到胞質(zhì)中。以上說明NFAT信號可以作為刺激信號的下游效應(yīng)分子在心肌肥大性反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

5 Ca2+-CaN-NFATc4信號通路與心肌纖維化(MF)

MF是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，其變化存在于多種心血管疾病中，與心律失常、 心力衰竭等密切相關(guān)。所以預(yù)防和及時改善MF是降低心血管疾病死亡率重要措施。MF是以成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)過量堆積和其本身表型改變分化成纖維母細(xì)胞為主要特點的一種病理現(xiàn)象〔21〕。MF是十分復(fù)雜的病理過程，可能有多信號通路介導(dǎo)。羥脯氨酸作為膠原代謝和產(chǎn)生的指示劑已得到廣泛應(yīng)用，目前研究發(fā)現(xiàn)通過抑制CaN途徑可有效消除由去氧腎上腺素誘導(dǎo)的羥脯氨酸堆積和NFAT的核內(nèi)轉(zhuǎn)移〔22〕，提示CaN途徑在細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用；而膠原又是心肌細(xì)胞纖維化過程中產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)重要成分，這表明CaN途徑在MF過程中有重要意義。Herum等〔23〕對多配體蛋白聚糖-4介導(dǎo)的機械壓力負(fù)荷性MF的研究中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)心臟成纖維細(xì)胞受到機械性壓力負(fù)荷時，多配體蛋白聚糖-4會通過激活CaN途徑，增加膠原Ⅰ、膠原Ⅲ mRNA水平，同時平滑肌肌動蛋白(SMA)水平和纖維組織也有所增加〔23〕。因此阻斷多配體蛋白聚糖-4胞內(nèi)段與CaN之間的相互作用進(jìn)而抑制其下游效應(yīng)分子NFAT誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，可能有效減弱壓力負(fù)荷性MF水平。鈣信號對激活一些鈣敏感性酶如蛋白激酶C、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ和CaN是必不可少的。磷脂酶C活化可催化PIP2產(chǎn)生IP3和DAG。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體結(jié)合，釋放鈣離子?；罨腃aN使NFAT活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活其應(yīng)答基因〔24〕。

腺苷是普遍存在的嘌呤核苷，它的存在對細(xì)胞功能的調(diào)控有重要作用。在心血管系統(tǒng)中腺苷呈現(xiàn)出豐富功能：冠狀動脈擴張、心率控制、房室節(jié)律、心肌肥大和MF等方面。腺苷通過與其位于胞膜外受體(AR1、AR2A、AR2B、AR3)結(jié)合，AR胞內(nèi)段再與G蛋白耦聯(lián)作用激活下游一系列級聯(lián)反應(yīng);腺苷酸環(huán)化酶(AC)和PLC被激活，分別活化下游環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和PIP2。激活不同腺苷受體在MF方面有不同作用〔25〕。AR2A受體活化有抗纖維化作用〔26〕，PI3K激活并進(jìn)入細(xì)胞核抑制促纖維化基因表達(dá)，降低膠原產(chǎn)生;而另外三種腺苷受體則可能表現(xiàn)為促MF作用，其中AR1、AR3通過抑制腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)而抑制PI3K，AR2B則通過使PIP2活化產(chǎn)生IP3和DAG，進(jìn)一步使鈣通道活化釋放鈣離子。鈣離子釋放使鈣依賴性酶CaN激活，進(jìn)而使CaN/NFATc信號通路活化。由此可見，活化的腺苷受體可能通過CaN途徑激活促纖維化基因的表達(dá),但具體機制需進(jìn)一步研究證明。

6 Ca2+-CaN-NFATc信號通路與冠心病

冠心病是動脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變最常見類型，也是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。報道表明CaN/NFATc信號通路在冠狀動脈平滑肌細(xì)胞和血管壁形成中有重要作用〔27〕，通過染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)檢測出NFATc4可以促進(jìn)Smad2 轉(zhuǎn)錄，后者作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β下游信號的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，當(dāng)TGF-β與其受體結(jié)合后招募smad蛋白并使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄平滑肌增殖分化基因，促進(jìn)冠狀動脈管壁形成。內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說認(rèn)為冠狀動脈粥樣硬化各種主要危險因素最終都損傷動脈內(nèi)膜，而粥樣硬化病變的形成是動脈對內(nèi)皮、內(nèi)膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果。目前認(rèn)為氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最重要的致粥樣硬化因子，是損傷內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的主要因子。在Bear等〔28〕研究中發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠協(xié)同β-磷酸甘油共同促進(jìn)原代培養(yǎng)的動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子Osx并向成骨細(xì)胞分化，并提出在機體內(nèi)oxLDL可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和血管鈣化。有研究顯示NFAT信號在介導(dǎo)oxLDL損傷血管平滑肌過程中起重要作用〔29〕，NFAT信號可以介導(dǎo)經(jīng)oxLDL誘導(dǎo)的血管平滑肌鈣化和向骨母樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而二者均為動脈粥樣硬化過程中重要的一部分,然而研究只涉及NFATc1和NFATc2兩種因子，至于NFATc4(NFAT3)是否存在類似的作用尚無明確證據(jù)報道，但是NFAT3在心血管系統(tǒng)中有豐富表達(dá)，不難預(yù)測NFAT3在介導(dǎo)oxLDL誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用，但仍需進(jìn)一步實驗研究證明。

綜上，CaN/NFAT3信號通路在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，其可參與調(diào)控心肌肥大、MF等過程，在冠心病進(jìn)程中也有調(diào)控作用；雖然NFAT3信號在心血管系統(tǒng)中作用得到肯定，但是其具體機制還有待進(jìn)一步闡明，這對于針對其特異性藥物的應(yīng)用意義重大。鈣信號特異性阻斷藥物在臨床應(yīng)用常見，但這勢必會產(chǎn)生一些副作用，NFAT3信號作為鈣信號的下游重要成分發(fā)揮作用，針對其特異性阻斷藥物在臨床應(yīng)用少見報道，未來應(yīng)著眼于明確NFAT3信號在心血管系統(tǒng)中作用機制研究，并進(jìn)一步探索其可能存在的下游分子，進(jìn)而研制出更為精確的靶向藥物。