孫 葉，鄭兆娟，徐明月，歐陽嘉

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

乳清是牛奶奶酪加工過程中的一種副產(chǎn)物，存在于牛奶酪蛋白凝固過程中的水相里，占牛奶體積的85%～95%。乳清富含乳糖(45～50 g/L)、可溶性蛋白質(zhì)(6～8 g/L)、脂質(zhì)(4～5 g/L)、礦物鹽(80～100 g/L)等，含有55%的牛奶營(yíng)養(yǎng)[1]。由于處理乳清的生化需氧量(BOD)為27～60 g/L，化學(xué)需氧量(COD)為50～102 g/L，因此，乳清被認(rèn)為是一種嚴(yán)重的環(huán)境污染物[2]。世界年產(chǎn)乳清約9×107t，其中50%被當(dāng)作廢水排放，這不僅浪費(fèi)資源，更污染環(huán)境。為了使大量工業(yè)盈余的乳清變廢為寶，研究者利用乳清水解物生產(chǎn)乳清飲料、糖漿以及食品添加劑等化學(xué)品[3]。此外，乳清水解物還可以用于生產(chǎn)燃料乙醇，此研究近年來受到研究者的廣泛關(guān)注。乳清粉是乳清濃縮干燥的產(chǎn)物，相對(duì)于乳清來說，乳清粉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度高、可以長(zhǎng)期穩(wěn)定放置、乙醇得率高、后續(xù)分離成本低，是一種更好的乙醇生產(chǎn)原料[4]。

目前，以乳清粉為原料發(fā)酵制備乙醇的菌種一般為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)[5-6]和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[7-8]，其中，釀酒酵母是一種乙醇生產(chǎn)的傳統(tǒng)菌株，但它不能直接利用乳糖，需要先將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。利用釀酒酵母發(fā)酵乳清生產(chǎn)乙醇的方式有分步糖化發(fā)酵(SHF)和同步糖化發(fā)酵(SSF)。SHF可以分別控制乳糖水解和乙醇發(fā)酵的工藝條件，使得水解和發(fā)酵過程都在最適條件下進(jìn)行。SSF可以使乳糖水解生成的單糖被及時(shí)發(fā)酵為乙醇，在發(fā)酵過程中單糖不積累，可避免底物抑制現(xiàn)象出現(xiàn)。此外，SSF中較低的葡萄糖濃度可有效避免雜菌污染，而且可以加速體系中其他糖的利用[9-11]。

本文中，筆者分別研究釀酒酵母利用高濃度乳清粉分步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵制備乙醇的工藝條件，以期獲得更高的乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

乳糖、葡萄糖、半乳糖、β-半乳糖苷酶，Sigma公司；乳清粉(其中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.0%，pH 6.4)，安徽工藝貿(mào)易進(jìn)出口有限公司。

其他生化試劑為進(jìn)口產(chǎn)品或國(guó)產(chǎn)市售分析純產(chǎn)品。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

釀酒酵母NL22于4 ℃保存在葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，保存于南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所。

葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母汁3，瓊脂粉15；自然pH。

活化和增殖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖或半乳糖20，蛋白胨5，酵母汁3；自然pH。

發(fā)酵培養(yǎng)基：純糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中，加不同濃度的葡萄糖和半乳糖，額外補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)鹽至如下終質(zhì)量濃度((NH4)2SO41.2 g/L，MgSO40.4 g/L，ZnCl20.4 g/L，CaCl21 g/L)；SHF實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中，添加不同濃度乳糖的乳清粉在pH 6.0、60 ℃條件下酶解14 h后的酶解液；SSF實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中為添加不同濃度乳糖的乳清粉水溶液，其初始pH為6.0(SSF 實(shí)驗(yàn)中pH優(yōu)化除外)。

1.3 菌種培養(yǎng)方法

1.3.1 活化培養(yǎng)

將菌種從葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基接種至裝有50 mL活化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 增殖培養(yǎng)

將活化培養(yǎng)液接種至裝有100 mL增殖培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))，在30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將增殖后的增殖培養(yǎng)液于6 000 r/min離心10 min，取釀酒酵母菌泥接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，調(diào)整初始OD為5，在30 ℃、150 r/min的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

1.4 分析方法

乳糖、葡萄糖、半乳糖和乙醇均采用高效液相色譜(HPLC Agilent 1200，安捷倫公司)分析，外標(biāo)法測(cè)定。色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H 色譜柱(7.8 mm×300 mm)，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，采用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 活化和增殖培養(yǎng)基中碳源種類對(duì)釀酒酵母發(fā)酵葡萄糖和半乳糖的影響

Escalante-chong等[12]曾報(bào)道不同的碳源誘導(dǎo)模式可以影響半乳糖(GAL)啟動(dòng)子控制下的半乳糖代謝基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，為此，筆者研究了葡萄糖和半乳糖分別作為活化增殖碳源時(shí)對(duì)釀酒酵母純糖發(fā)酵的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出：以半乳糖作為菌種活化增殖碳源，無論發(fā)酵培養(yǎng)基為何種碳源，都不會(huì)影響碳源利用和乙醇生產(chǎn)；但以葡萄糖作為菌種活化增殖碳源，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為半乳糖時(shí)，半乳糖利用速度明顯變慢。Hahn-H?gerdal[13]和O′Leary[14]等也報(bào)道過類似實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，全部采用半乳糖作為活化增殖培養(yǎng)基的唯一碳源，以加速發(fā)酵時(shí)葡萄糖和半乳糖的利用速度。

2.2 分步糖化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

2.2.1 pH、溫度和乳糖濃度對(duì)乳清粉酶解程度的影響

配制含不同濃度乳糖的乳清粉溶液，調(diào)整溶液pH分別為4、5、6、7和8，在30～80 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶解，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶(以乳糖為底物，在37 ℃、pH 7的條件下，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位)，監(jiān)測(cè)12 h的乳糖水解得率，結(jié)果見表2。

由表2可以看出：在pH為5～7時(shí)，乳糖酶解效果差異不大，后續(xù)選擇pH 6作為乳清粉酶解條件。當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)，乳糖酶解速度相對(duì)最快，得率最高。而溫度過高，則會(huì)導(dǎo)致β-半乳糖苷酶活力較快喪失，酶解效果不佳。隨著乳糖濃度的增大，酶解得率變化不大。當(dāng)初始乳糖的質(zhì)量濃度為200 g/L時(shí)，酶解12 h，酶解得率為94.80%。

表1 活化和增殖培養(yǎng)基碳源種類對(duì)釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響

表2 利用乳清粉/乳清為原料產(chǎn)乙醇

2.2.2 乳清粉酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇

配制乳糖質(zhì)量濃度分別為50和200 g/L的乳清粉溶液，在最優(yōu)條件下酶解14 h使水解徹底，之后接入釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中取樣測(cè)定葡萄糖、半乳糖和乙醇濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 乳清粉酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程曲線Fig.1 Production of ethanol from enzymatic hydrolysates

由圖1可以看出：低濃度乳清酶解液中葡萄糖的利用速度略高于半乳糖，葡萄糖在6 h內(nèi)迅速消耗完全，而半乳糖也在12 h內(nèi)基本消耗完全。在高濃度乳清酶解液的發(fā)酵過程中，半乳糖的利用呈現(xiàn)出明顯的滯后性，只有在發(fā)酵36 h后，葡萄糖消耗殆盡了，半乳糖才開始加速消耗，最終乙醇質(zhì)量濃度為60.36 g/L，產(chǎn)率為0.72 g/(L·h)。

2.3 同步糖化發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

分步糖化發(fā)酵中，較高濃度的葡萄糖會(huì)抑制釀酒酵母對(duì)半乳糖的利用。而同步糖化發(fā)酵中，由于乳清水解和單糖發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，這使得發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度一直維持在相對(duì)較低的水平，有助于解除葡萄糖抑制效應(yīng)。

2.3.1 pH和溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

基于前期研究發(fā)現(xiàn)，本研究中使用的β-半乳糖苷酶適宜pH為4～7，而釀酒酵母發(fā)酵最佳初始pH為中性偏酸，為保證酶解和發(fā)酵均能良好進(jìn)行，研究了SSF條件下不同初始pH對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響，配制乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液，β-半乳糖苷酶用量為10 U/g乳糖，同步糖化發(fā)酵36 h后所得乙醇產(chǎn)量如圖2所示。

圖2 pH對(duì)SSF的影響Fig.2 Effects of pH on SSF

由圖2可知：當(dāng)初始pH為5和6時(shí)，所產(chǎn)乙醇濃度最高。此外，SSF過程中，發(fā)酵液的pH呈逐漸下降趨勢(shì)，因此，初始pH(pH=7)略高于最適pH時(shí)，乙醇產(chǎn)量下降較少，但初始pH(pH=4)略低于最適pH時(shí)，乙醇產(chǎn)量大幅度下降?；诖?，選擇pH 6作為初始發(fā)酵pH。

對(duì)絕大多數(shù)釀酒酵母而言，良好的發(fā)酵能力一般處在25～32 ℃的溫度范圍內(nèi)，而本文中的β-半乳糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃左右。本實(shí)驗(yàn)采用初始乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉作為底物，β-半乳糖苷酶用量為10 U/g乳糖，分別于24、27、30、33和36 ℃下同步糖化發(fā)酵36 h，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)SSF的影響Fig.3 Effects of temperature on SSF

由圖3可以看出：在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)提高溫度對(duì)SSF過程有利。當(dāng)溫度超過30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，雖然β-半乳糖苷酶的活性增加，但高溫可能對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)不利，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量下降較快。后續(xù)選擇30 ℃作為同步糖化發(fā)酵的控制溫度。

2.3.2 不同濃度乳清粉的同步糖化發(fā)酵

考察不同底物濃度對(duì)同步糖化發(fā)酵過程的影響。分別配制乳糖質(zhì)量濃度為50、100以及200 g/L的乳清粉溶液，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶，在最優(yōu)條件下發(fā)酵，發(fā)酵過程中取樣測(cè)定乳糖、葡萄糖、半乳糖和乙醇濃度，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度乳清粉的同步糖化發(fā)酵過程曲線Fig.4 Production of ethanol with different concentrations of whey power

由圖4可以看出：同步糖化發(fā)酵過程中，無論初始乳清粉加入多少，葡萄糖都不會(huì)積累，半乳糖在前6 h內(nèi)濃度上升，之后迅速下降直至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)以乳糖質(zhì)量濃度為50 g/L的乳清粉溶液為底物時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度最高為23.46 g/L，產(chǎn)率為1.96 g/(L·h)。提高乳清粉濃度，乙醇產(chǎn)量隨之上升，但產(chǎn)率下降。當(dāng)以乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液為底物時(shí)，最終乙醇質(zhì)量濃度為58.58 g/L，產(chǎn)率為1.63 g/(L·h)。在同步糖化發(fā)酵初始乳糖質(zhì)量濃度增至200 g/L時(shí)，發(fā)酵效率略有下降。一方面，發(fā)酵前期(6 h)乳糖糖化產(chǎn)生的葡萄糖及時(shí)轉(zhuǎn)化成乙醇，減少了其對(duì)乳糖水解的抑制效應(yīng)，另一方面，體系中持續(xù)低水平的葡萄糖濃度和乳糖糖化產(chǎn)生的半乳糖不斷積累可能誘導(dǎo)了半乳糖代謝相關(guān)酶的生成[12]，這兩者使得體系中的半乳糖被高效迅速地轉(zhuǎn)化。

綜上，與SHF相比，SSF大大加快了乙醇生產(chǎn)速率。在后續(xù)補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵中，筆者選擇200 g/L為乳清粉乳糖的初始質(zhì)量濃度。

2.4 補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

在工業(yè)上，高濃乙醇發(fā)酵可以大大降低乙醇蒸餾成本和提高設(shè)備利用率[15]。為進(jìn)一步提高乳清粉乙醇生產(chǎn)潛力，嘗試如下分批補(bǔ)料工藝。

配制乳糖質(zhì)量濃度為200 g/L的乳清粉溶液，調(diào)整溶液pH為6，按照10 U/g乳糖加入相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶，在最適條件下發(fā)酵。發(fā)酵8 和12 h時(shí)分別補(bǔ)加1次終質(zhì)量濃度約100 g/L的乳清粉，同時(shí)補(bǔ)加相應(yīng)量的β-半乳糖苷酶。發(fā)酵過程曲線如圖5所示。

圖5 補(bǔ)料糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇Fig.5 Production of ethanol by fed-batch SSF

由圖5可以看出：發(fā)酵體系中的葡萄糖濃度一直處于非常低的水平，半乳糖濃度隨著乳清粉添加和酶解進(jìn)行不斷升高，在20 h時(shí)半乳糖濃度達(dá)到最高值，之后快速下降。乙醇濃度在前12 h內(nèi)增加較快，之后速度放緩。發(fā)酵12 h后，乙醇質(zhì)量濃度為63.78 g/L，產(chǎn)率為5.32 g/(L·h)；發(fā)酵68 h后，乙醇質(zhì)量濃度為118.52 g/L，產(chǎn)率為1.74 g/(L·h)。補(bǔ)料發(fā)酵過程中，葡萄糖的發(fā)酵速率遠(yuǎn)大于酶解生成葡萄糖的速率，通過及時(shí)補(bǔ)料使得菌體保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期中進(jìn)行生長(zhǎng)和乙醇的積累。此外，初期半乳糖的發(fā)酵速率不高，在釀酒酵母交替利用葡萄糖和半乳糖的過程中，半乳糖積累并使得酵母被馴化，逐漸加快半乳糖的利用速度。

與現(xiàn)有報(bào)道中以乳清等原料進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的研究相比，結(jié)果見表3。由表3可知，本研究在乙醇產(chǎn)量和產(chǎn)率上都具有一定優(yōu)勢(shì)，具有良好開發(fā)運(yùn)用前景。此外，與當(dāng)下文獻(xiàn)中研究較多的玉米、木薯、甘蔗和秸稈原料的燃料乙醇生產(chǎn)相比，乳清粉原料在乙醇生產(chǎn)時(shí)具有“不與人爭(zhēng)糧”、運(yùn)輸與儲(chǔ)存成本相對(duì)較低、預(yù)處理方法簡(jiǎn)單以及環(huán)境污染小等顯著優(yōu)勢(shì)。

表3 利用乳清粉/乳清為原料產(chǎn)乙醇

3 結(jié)論

1)S.cerevisiaeNL22能快速利用高濃度乳清粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，使得其在對(duì)乳清粉酶解發(fā)酵上展現(xiàn)了良好應(yīng)用前景。

2)與分步糖化發(fā)酵相比，采用同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇可明顯縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。

3)同步糖化發(fā)酵的最適pH為6，最適溫度為30 ℃，在上述條件下進(jìn)行補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵，最終乙醇質(zhì)量濃度為118.52 g/L，產(chǎn)率為1.74 g/(L·h)。

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