張 鵬，林 駿，盧 元

(1. 清華大學(xué) 化學(xué)工程系，北京 100084； 2. 中國石油大學(xué)(北京) 新能源研究院，北京 102249)

生物技術(shù)的進步使得合成生物學(xué)家可快速可靠地改造生物體系及設(shè)計生產(chǎn)生物大分子，尤其是具備生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)大分子的設(shè)計生產(chǎn)。在過去多年合成生物學(xué)的發(fā)展中，主要以細胞為宿主對蛋白質(zhì)進行工程化設(shè)計,但是在細胞內(nèi)部進行工程化是費時和困難的。主要原因在于細胞的生長及適應(yīng)性過程通常與工程設(shè)計目標(biāo)是不一致的，并且由于活細胞生命系統(tǒng)的復(fù)雜性、基因元件難以標(biāo)準(zhǔn)化、細胞膜的阻礙等，這大大限制了生物組件的改造[1]。這些限制使人們試圖探索新的發(fā)展方向，因而推動發(fā)展了一項新的工程技術(shù)——無細胞合成生物學(xué)。探究歷史，最初無細胞合成的雛形和代表性工作要追溯到1961年，Nirenberg和Matthaei用無細胞合成進行創(chuàng)新性實驗，在發(fā)現(xiàn)遺傳密碼子方面發(fā)揮了重要作用[2]。而現(xiàn)在，無細胞合成生物學(xué)的發(fā)展使得其在蛋白質(zhì)合成中顯示出巨大的作用，包括合成細胞難以表達的膜蛋白、制造高附加值的生物醫(yī)藥蛋白、非天然元件的嵌入以及高通量篩選等[3]。

無細胞蛋白合成系統(tǒng)是以外源DNA或mRNA為模板，在體系中補充底物和能量物質(zhì)，在細胞抽提物提供的多種酶的作用下合成蛋白質(zhì)的體外表達系統(tǒng)(圖1)。細胞抽提物可以來自不同種類的細胞，主要包括大腸桿菌[4]、小麥胚芽細胞[5]、兔網(wǎng)織紅細胞[6]和昆蟲細胞[7]等。要特別強調(diào)的是，另一類以純化組分為基礎(chǔ)的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)不在此討論范圍內(nèi)。無細胞蛋白合成系統(tǒng)以DNA或mRNA為模板，提供了靈活多變的蛋白表達方式。與傳統(tǒng)的細胞體內(nèi)表達系統(tǒng)相比，無細胞蛋白合成系統(tǒng)具有眾多優(yōu)點：因沒有細胞膜的阻隔，外源性的物質(zhì)可以直接加入到反應(yīng)體系中，從而對反應(yīng)條件進行針對性的調(diào)控，例如促進蛋白的折疊或進行翻譯后修飾[8]；因不存在活細胞，該體系可用于表達在胞內(nèi)系統(tǒng)中難以表達的蛋白質(zhì)，如對細胞有毒害作用的抗菌肽[9]和離子通道蛋白[10]等，同時表達過程也不受細胞生長代謝的影響；由于其開放性的特點，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)能夠與其他的高通量手段或工具相耦聯(lián)，開發(fā)新型的高通量復(fù)合研究手段。最后，無細胞形式允許進行篩選而不需要基因克隆步驟，從而實現(xiàn)快速的工藝/產(chǎn)品開發(fā)[11]。

圖1 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)Fig.1 Cell-free protein synthesis systems

盡管無細胞系統(tǒng)相比細胞系統(tǒng)有諸多優(yōu)勢，但在發(fā)展初期，幾個障礙因素限制了它們在蛋白質(zhì)工程及生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的使用。這些障礙因素包括反應(yīng)持續(xù)時間短、蛋白質(zhì)生產(chǎn)率低、模板不穩(wěn)定及易降解等。此外，還有昂貴的試劑成本、反應(yīng)量小以及復(fù)雜蛋白質(zhì)的合成較為困難等因素。然而，過去十幾年的技術(shù)進步已經(jīng)解決了這些局限性，并重新優(yōu)化了無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，以滿足日益增長的蛋白質(zhì)合成需求。

在本文中，筆者首先介紹不同的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，接著講述無細胞合成蛋白質(zhì)系統(tǒng)的技術(shù)發(fā)展，最后重點介紹無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的前沿應(yīng)用。

1 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)簡介

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)利用了微生物、植物或動物細胞裂解物中的能量和蛋白質(zhì)合成所必需的催化成分來生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)。雖然任何生物體都可以提供裂解物，但最常見的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的裂解物是大腸桿菌、小麥胚芽、兔網(wǎng)織紅細胞和昆蟲細胞的抽提物。這些細胞本身的特性不同，從它們中得到的提取物必然也是不同的。因此，使用無細胞蛋白合成系統(tǒng)生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)首先要選擇合適的提取物來源。表1總結(jié)了不同來源提取物的無細胞合成系統(tǒng)，并進行了比較。

由表1可見：最常用的是原核大腸桿菌提取物系統(tǒng)。因為第一，大腸桿菌可以使用廉價培養(yǎng)基培養(yǎng)，直接高壓破碎進行細胞裂解，提取物的制備簡單且便宜；第二，大腸桿菌的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)在間歇反應(yīng)中能得到最高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從數(shù)百微克/毫升到毫克/毫升，這取決于目的蛋白質(zhì)的種類。第三，大腸桿菌提取物系統(tǒng)的反應(yīng)成本最低。因為它能夠激活提取物中的代謝反應(yīng)，從而促進高水平的蛋白質(zhì)合成，避免使用昂貴的能量底物[3]。

小麥胚芽、兔網(wǎng)織紅細胞和昆蟲細胞提取物系統(tǒng)也是常用的真核無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。與原核大腸桿菌系統(tǒng)相比，這些真核提取物系統(tǒng)在生產(chǎn)某些復(fù)雜蛋白質(zhì)方面具有優(yōu)勢，可以實現(xiàn)翻譯后修飾[4]。然而，真核無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)提取物制備程序復(fù)雜且昂貴，在間歇反應(yīng)中蛋白質(zhì)產(chǎn)量低。

迄今為止,盡管開發(fā)的每個無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)都具有優(yōu)點，但必須仔細考慮產(chǎn)量、成本和翻譯后修飾之間的權(quán)衡，從而進行系統(tǒng)的選擇。

表1 不同無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的比較

2 無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展

無細胞蛋白質(zhì)合成要達到最大產(chǎn)量必須滿足一些要求，包括足夠的底物供應(yīng)、穩(wěn)態(tài)環(huán)境以及沒有抑制性副產(chǎn)物產(chǎn)生。這和生長快速的完整細胞的體內(nèi)狀態(tài)特征一致。因此，優(yōu)化無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的指導(dǎo)原則是通過在體外模擬細胞質(zhì)高效的系統(tǒng)來激活生物學(xué)過程。而無細胞蛋白合成系統(tǒng)的發(fā)展與基因表達模板、代謝調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊及工程化研究等進展相關(guān)聯(lián)。

2.1 基因表達模板

在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，基因模板的穩(wěn)定性是制約系統(tǒng)效率提高的一個關(guān)鍵因素。在常規(guī)的無細胞蛋白質(zhì)表達過程中，一般使用質(zhì)粒為模板，以提高整個系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。然而，使用質(zhì)粒為模板必須進行分子克隆、轉(zhuǎn)化以及宿主菌培養(yǎng)、質(zhì)粒純化等繁瑣步驟。該方式僅適合于研究單個或者少數(shù)幾個基因的體外表達情況，對于要求高通量篩選的研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)研究或蛋白質(zhì)分子的定向進化研究等，以質(zhì)粒為模板的表達方式則有效率低的問題。

以線性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物作為模板，直接由快速PCR反應(yīng)擴增得到目的基因，可避免質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、宿主菌培養(yǎng)等步驟，簡化了無細胞蛋白質(zhì)合成的前期準(zhǔn)備工作，具有極好的高通量潛力。然而，與質(zhì)粒模板相比，線性模板更脆弱，極易受到提取物中核酸酶的攻擊而迅速被降解，從而導(dǎo)致表達的目標(biāo)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率極低，且對目標(biāo)蛋白質(zhì)功能檢測有很大的影響。因此，基因表達模板初期的研究重心放在對菌株的基因改造上。Ahn等[12]采用敲除了編碼核酸內(nèi)切酶E基因的菌株制備無細胞抽提物，這樣大大增加了DNA模板的穩(wěn)定性。除了對菌株進行基因改造以營造一個缺失核酸酶的無細胞反應(yīng)環(huán)境外，調(diào)整模板自身結(jié)構(gòu)以抵御外界核酸酶攻擊則可能是一種更為有效的方法。Wu等[13]通過設(shè)計特殊引物最終將線性片段形成了類似于質(zhì)粒的環(huán)形DNA分子，提高了目的基因片段對核酸外切酶的抵御能力。

通過提高局部有效模板濃度是提高無細胞蛋白質(zhì)合成產(chǎn)量的另一種方法。Park等[14]將線性模板DNA分子與X形DNA銜接以產(chǎn)生用于組合的無細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的DNA水凝膠。與可溶性DNA模板對照相比，在小麥胚芽無細胞系統(tǒng)中，該方法使得蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高了300倍。這是因為對內(nèi)源性DNA酶消化的基因進行保護，可通過降低DNA溶解度以產(chǎn)生更高的總基因濃度，同時由于基因的局限定位產(chǎn)生更快的酶周轉(zhuǎn)率，從而提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

2.2 代謝調(diào)控

1999年開始，Kim和Swartz課題組進行的一系列實驗揭示了代謝網(wǎng)絡(luò)[15-17]。他們的實驗結(jié)果表明：可以將蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)化為可分析和控制的生化反應(yīng)，推動了無細胞蛋白質(zhì)合成的發(fā)展。實現(xiàn)細胞質(zhì)模擬對高活性無細胞系統(tǒng)是至關(guān)重要的，因為它能夠減輕無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)受到的基質(zhì)限制，從而提高產(chǎn)量。近年來，通過改變提取物制備方法得到更好的提取物，這些技術(shù)激活了無細胞合成蛋白質(zhì)的中樞代謝，擴大了反應(yīng)規(guī)模。最近對大腸桿菌提取物制備方法中的每個步驟都進行了系統(tǒng)優(yōu)化。例如，開發(fā)了新的培養(yǎng)基用于源細胞的持續(xù)生長[18]，通過高密度發(fā)酵來生產(chǎn)提取物[19]，同時制備方法的簡化可減少時間和成本。優(yōu)化提取物制備方法有利于無細胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的放大。

激活細胞提取物中蛋白質(zhì)合成能力是非常重要的。通過刺激中樞代謝來給高水平無細胞蛋白質(zhì)合成供應(yīng)能量，而不是由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等昂貴的化合物來供應(yīng)能量。Jewett等[20]研究在反應(yīng)中激活中樞代謝，氧化磷酸化和蛋白質(zhì)合成，為蛋白質(zhì)合成提供能量(在2 h內(nèi)達到1.2 mg/mL)。除了激活有益的途徑，還可以除去有害的途徑。例如，通過刪除編碼有害酶的基因使氨基酸底物穩(wěn)定化，實現(xiàn)高水平的無細胞蛋白質(zhì)合成[3,21-22]。

2.3 蛋白質(zhì)折疊

在過去十幾年中，研究者試圖高效合成復(fù)雜蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)的功能與它能否正確折疊有關(guān)。為了折疊復(fù)雜的蛋白質(zhì)，無細胞系統(tǒng)必須將靶蛋白的疏水區(qū)域彼此屏蔽，提供適宜的天然化學(xué)環(huán)境，并加入輔助因子如鐵-硫簇，促進二硫鍵的形成和異構(gòu)化。無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一個主要困難是復(fù)制體內(nèi)氧化折疊途徑，促進二硫鍵的形成和異構(gòu)化[23]。生物系統(tǒng)使用不同的區(qū)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)合成與氧化折疊分開，無細胞系統(tǒng)希望在一個空間中完成這兩項任務(wù)。盡管困難重重，但在含有多個二硫鍵的真核蛋白的折疊方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進展。Swartz及其同事研究發(fā)現(xiàn)，可以通過平衡氧化還原電位在無細胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中建立氧化環(huán)境，促進二硫鍵形成。他們通過使用碘乙酰胺預(yù)處理細胞提取物，使用谷胱甘肽緩沖液提供氧化環(huán)境，并提供形成二硫鍵的蛋白質(zhì)DsbC，成功合成了活性尿激酶[24]和截短形式的組織纖溶酶原激活物[23]。

為了形成和異構(gòu)化二硫鍵，幫助新生多肽達到其活性構(gòu)象而不聚集，也可以利用多種酶。添加這些酶分子對體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)是至關(guān)重要的。除天然折疊物之外，還可使用一些合成的物質(zhì)。Welsh等[25]將真核Hsp70伴侶BiP與觸發(fā)因子系在一起，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真核生物分泌的蛋白質(zhì)中可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)量得到改善。Sasaki等[26]通過將兩親性多糖納米凝膠摻入無細胞反應(yīng)來改善蛋白質(zhì)折疊，允許肽鏈的結(jié)合然后控制釋放，防止一些蛋白質(zhì)的聚集和錯誤折疊。這些例子展示了通過直接添加新組件來調(diào)整無細胞系統(tǒng)組件的設(shè)計自由度。

2.4 工程化研究

專注于底物可用性引起技術(shù)開發(fā)的重大轉(zhuǎn)變。例如，使用連續(xù)交換或雙層系統(tǒng)，被動擴散能夠補充基質(zhì)并除去副產(chǎn)物。封閉的批次系統(tǒng)使所提供能量基質(zhì)得到有效利用，且易于放大以及許多蛋白質(zhì)的平行表達。另外，連續(xù)進料可以大大延長系統(tǒng)的反應(yīng)壽命和蛋白質(zhì)產(chǎn)量[27]。

冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展也推動了無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展，運用冷凍干燥技術(shù)，將配好的無細胞體系與基因模板分別冷凍干燥，當(dāng)需要它們反應(yīng)時，只需將它們混合在一起，加水活化即可，它們之間就能發(fā)生反應(yīng)合成蛋白質(zhì)。通常，冷凍干燥能使它們的活性在室溫下保持一年[28]。結(jié)合活化有效能量代謝的進展，支持長壽命蛋白質(zhì)生產(chǎn)與新的提取物制備方法，Zawada等[29]開發(fā)了一種大型大腸桿菌無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，他們開發(fā)的無細胞合成系統(tǒng)能夠在100 L的規(guī)模下10 h內(nèi)產(chǎn)生700 mg/L的人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)。這種技術(shù)使蛋白質(zhì)藥物的商業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

3 前沿應(yīng)用

3.1 基因電路開發(fā)

模塊化基因電路的開發(fā)是合成生物學(xué)家工具箱中的重要工具，因為它允許快速組裝和控制新穎的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在體內(nèi)基因電路方面已經(jīng)取得了進展。然而，體外方法提供了更加獨特的優(yōu)點，包括：反應(yīng)環(huán)境的控制和可預(yù)測性；允許加速原型設(shè)計；更易對反應(yīng)電路進行真正模塊化。一個應(yīng)用例子是加速原型循環(huán)設(shè)計開發(fā)，允許在8 h內(nèi)對4組分遺傳開關(guān)進行原型設(shè)計[30]。

利用無細胞系統(tǒng)設(shè)計原型周期的快速性，已經(jīng)設(shè)計了許多無細胞電路，如邏輯門[31]、存儲元件[32]和振蕩器[33]。這些無細胞遺傳電路的應(yīng)用是簡化人工細胞和細胞樣微器件的工程設(shè)計。一個應(yīng)用例子是在33 fL～16 pL的微乳液滴中振蕩器的演示[34]。在每個微乳液中，通過初始試劑濃度的變化產(chǎn)生豐富多樣的反應(yīng)群體。這種誘導(dǎo)的變異性可以用于以超高通量方式產(chǎn)生大數(shù)據(jù)集，用于表征非線性生化網(wǎng)絡(luò)和電路行為的參數(shù)估計。

3.2 膜蛋白

膜蛋白合成是另一個非常受到重視的應(yīng)用。據(jù)報道，膜蛋白占所有潛在藥物靶標(biāo)的3/4[35]。然而，由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、疏水跨膜區(qū)域、對宿主的毒性、所需的耗時長且低效率的折疊步驟，使得它們在體內(nèi)大量表達難以實現(xiàn)?，F(xiàn)在證據(jù)表明使用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以生產(chǎn)用于生物化學(xué)或結(jié)構(gòu)研究的高水平表達膜蛋白，現(xiàn)將成功的例子總結(jié)于表2中。使用無細胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)合成膜蛋白的關(guān)鍵思路是在有助于溶解膜蛋白質(zhì)的脂質(zhì)或去污劑的存在下合成膜蛋白。例如，直接添加表面活性劑或純化的脂質(zhì)可以防止膜蛋白多肽的聚集[41]；也可以用純化的大腸桿菌磷脂雙層囊泡來代替表面活性劑，使用這種方法，成功表達了兩種膜蛋白——四環(huán)素泵(TetA)和甘露醇通透酶(MtlA)，分別獲得了高達570 μg/mL和130 μg/mL的產(chǎn)量，產(chǎn)量是細胞表達方法的400倍[42]。

Noireaux等[43]利用磷脂囊泡封閉無細胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，通過表達孔形成蛋白α-溶血素，蛋白質(zhì)能夠成功整合到磷脂雙層中并形成小分子選擇性滲透通道。該技術(shù)也可應(yīng)用于進一步探究膜蛋白和磷脂雙層的相互作用。

表2 無細胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)用于膜蛋白的合成

3.3 生物醫(yī)藥蛋白

由于成本、工業(yè)放大和蛋白質(zhì)折疊不再是無細胞技術(shù)不可逾越的障礙，因此可以利用無細胞蛋白質(zhì)合成進行商業(yè)化生物醫(yī)藥蛋白的生產(chǎn)。首先，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以用于抗體的生產(chǎn)。例如，在生產(chǎn)HER2抗體和抗體片段時，加入分子伴侶(酵母和大腸桿菌蛋白二硫鍵異構(gòu)酶)以促進原核無細胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量的活性蛋白質(zhì)，產(chǎn)量高達300 mg/L[44]。

其次，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)還可以用來合成疫苗。無細胞合成系統(tǒng)的主要優(yōu)點是易于調(diào)整DNA模板濃度來優(yōu)化反應(yīng)，調(diào)整產(chǎn)物穩(wěn)定性和控制氧化還原電位來優(yōu)化二硫鍵的形成。這一控制使得研究人員能夠快速產(chǎn)生淋巴瘤個性化疫苗[7]。無細胞合成系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是能夠大量表達毒性蛋白質(zhì)。這可以改善疫苗的開發(fā)能力，特別是在瘧疾研究方面。因為在研究瘧疾時，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的蛋白質(zhì)基因中A/T含量高，所以無法在生物體內(nèi)產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)用于相關(guān)研究。例如，在大腸桿菌細胞中重組表達108個瘧疾蛋白，但是僅有60%能夠成功生產(chǎn)[45]。疫苗在體內(nèi)生產(chǎn)的另一個挑戰(zhàn)是易產(chǎn)生錯誤的糖基化免疫原性蛋白，這可能促進不正確的免疫應(yīng)答。Tsuboi等[45]使用小麥胚芽無細胞系統(tǒng)表達了478種瘧疾蛋白質(zhì)，避免了蛋白質(zhì)的糖基化，因為此無細胞系統(tǒng)中沒有糖基化酶。Doolan等[46]使用了一種補充含有稀有tRNA的大腸桿菌無細胞系統(tǒng)，以促進A/T豐富區(qū)的翻譯，成功表達了250種瘧疾相關(guān)蛋白，效率高于90%。因此，利用這些無細胞合成系統(tǒng)能夠產(chǎn)生快速疫苗篩選所必需的蛋白質(zhì)。

最后，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可用于類病毒顆粒的合成[45]。類病毒顆粒的合成也是疫苗領(lǐng)域非常受人關(guān)注的，它是一種或多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的自組裝復(fù)合物，尺寸為25～100 nm，在結(jié)構(gòu)上與病毒相似，它能引起免疫原性反應(yīng)，但不含有遺傳物質(zhì)，也沒有感染性，同時，病毒樣顆粒的多價特性增加了免疫原性，因此有多種功能。雖然在生物體內(nèi)生產(chǎn)病毒樣顆粒已經(jīng)進行了許多年，但仍然存在不能有效生產(chǎn)的問題，例如在生物體內(nèi)時，會出現(xiàn)細胞毒性和對單體蛋白過度表達的控制[47]。然而使用無細胞合成系統(tǒng)，可以快速優(yōu)化且穩(wěn)定生產(chǎn)的病毒樣顆粒。例如，用于疫苗開發(fā)的無細胞合成應(yīng)用是將非天然氨基酸摻入細菌鞭毛蛋白中，隨后將其固定在病毒樣顆粒上。當(dāng)輔因子和相關(guān)試劑被快速優(yōu)化后，鞭毛蛋白的產(chǎn)量從263 μg/mL增加到336.3 μg/mL。與游離鞭毛蛋白相比，病毒樣顆粒固定的鞭毛蛋白的生物活性提高了10倍，為新一代超級疫苗奠定了基礎(chǔ)[48]。

3.4 非天然氨基酸

非天然氨基酸嵌入是一個強大的合成生物學(xué)工具，它會導(dǎo)致獨特的化學(xué)基團嵌入蛋白質(zhì)。該技術(shù)具有許多應(yīng)用前景，如配體-蛋白質(zhì)相互作用、生物治療和生物催化等[49]。

非天然氨基酸嵌入有兩種主要的方法。一種是全局抑制，利用天然翻譯機器將非天然氨基酸嵌入蛋白質(zhì)；另一種是最常用的琥珀抑制，利用琥珀終止密碼子，依賴于正交的突變氨酰tRNA合成酶/tRNA配對，將非天然氨基酸嵌入蛋白質(zhì)。無細胞合成系統(tǒng)已成功應(yīng)用于這兩種方法，并且非常容易地通過優(yōu)化非天然氨基酸的濃度以避免非天然氨基酸嵌入的低效率瓶頸[49]。在無細胞合成系統(tǒng)中，還可通過優(yōu)化氨酰tRNA合成酶/tRNA配對、反應(yīng)條件的實時測定等來提高嵌入效率。另一種無細胞合成改善非天然氨基酸嵌入的方法是控制正交tRNA(otRNA)含量[50]，這種共表達是通過提供更高濃度的otRNA來提高產(chǎn)量，同時避免otRNA表達和純化之前成本昂貴的步驟。

3.5 高通量分析

在后基因組時代，高通量蛋白質(zhì)表達平臺變得越來越重要。無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的很多優(yōu)點可以滿足這一需求。第一，直接使用PCR模板，可避免時間長及操作繁瑣的分子克隆步驟；第二，經(jīng)濟高效的高產(chǎn)量分批反應(yīng)，使多孔(96或384孔)蛋白質(zhì)生產(chǎn)成為可行；第三，使用小型化和自動化的微芯片，使其具有巨大的應(yīng)用潛力；第四，沒有細胞壁屏障，使得反應(yīng)條件易被操縱，包括向系統(tǒng)摻入同位素標(biāo)記的氨基酸來跟蹤反應(yīng)。

在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中，可利用核磁共振(NMR)技術(shù)分析同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或用X線晶體學(xué)來研究相關(guān)蛋白，這些工作在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中起著至關(guān)重要的作用。無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的一個主要優(yōu)點是高的氨基酸嵌入效率及高蛋白表達產(chǎn)率。另外，在無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中表達的產(chǎn)物無需純化，可以直接進行核磁共振分析，目前已經(jīng)使用無細胞系統(tǒng)確定了數(shù)千種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

無細胞蛋白質(zhì)合成平臺也可作為大規(guī)模合成功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)文庫的基礎(chǔ)技術(shù)平臺。例如，使用無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)可以快速有效地產(chǎn)生蛋白原位陣列(PISA)，以全面研究微芯片上的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[51-52]。小麥胚芽無細胞合成系統(tǒng)被稱為“人類蛋白質(zhì)工廠”，試圖用來合成13 364個人類蛋白質(zhì)。在合成的蛋白質(zhì)(12 996個或總數(shù)的97.2%)中，許多蛋白質(zhì)經(jīng)測試后顯示了其特有的功能(例如75個測試的磷酸酶中的58個都有活性)，并且成功地將99.86%的蛋白質(zhì)印刷到載玻片上構(gòu)建成蛋白質(zhì)微陣列[53]。因為無細胞蛋白合成系統(tǒng)在合成時，無需將蛋白質(zhì)合成、純化和固定的步驟分開進行，所以這樣可更快地來探測蛋白質(zhì)的不同方面的功能。另外，結(jié)合功能化碳納米管材料，則降低蛋白質(zhì)的檢測限[54]。除了蛋白質(zhì)陣列之外，其他功能基因組學(xué)方法，如序列蛋白表達等，有望幫助揭示每一種基因所對應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能。

4 結(jié)語與展望

無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)作為一個強大的技術(shù)平臺，可以解決細胞表達系統(tǒng)難以解決的問題。無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)獨特的開放性，使得它能夠?qū)虮磉_、底物優(yōu)化和原位監(jiān)測等達到精確控制，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)合成的精確且個性化的工程設(shè)計。此外，隨著無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)成本的降低、效率的提高及工業(yè)放大化的逐步實現(xiàn)，使得無細胞合成系統(tǒng)不僅僅可以作為基礎(chǔ)研究工具，也可以作為良好的工業(yè)化生產(chǎn)平臺。將來，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的發(fā)展，需要進一步降低成本、提高效率，需要實現(xiàn)更好的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，同時提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性。此外，為了進一步拓展無細胞合成系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，需要和材料學(xué)、自動化和生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科進行更進一步的融合。

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