李婧

中國人民解放軍第89醫(yī)院（山東濰坊 261021）

骨作為一種致密的結(jié)締組織，在保護體內(nèi)器官和提供機械支持、造血、礦物質(zhì)儲存方面發(fā)揮重要作用。盡管骨具有再生和自我修復(fù)能力，但是嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除或先天性疾病造成的大段骨缺損只能采用骨移植的方法修復(fù)。鑒于自體骨和異體骨移植的相對局限性，組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損一直是近年來的研究熱點，其中作為天然組織和接種細(xì)胞之間橋梁的生物材料支架則是重要研究內(nèi)容[1，2]。為了獲得與天然骨相似的組成、結(jié)構(gòu)和功能，生物材料應(yīng)滿足以下方面：1.具有良好的生物相容性和生物活性，可調(diào)節(jié)的生物降解性，且降解率應(yīng)與新骨生長率匹配；2.具有模擬天然骨的結(jié)構(gòu)特征，為不同細(xì)胞和組織的生長提供必需的空間和環(huán)境，有利于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）形成、養(yǎng)料轉(zhuǎn)運和神經(jīng)血管長入；3.可塑性強，易于操作，能實現(xiàn)臨床上不同病例所需的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的重塑，提供長期的穩(wěn)定性；4.具有良好的成骨誘導(dǎo)性，能誘導(dǎo)接種細(xì)胞定向分化，促進骨組織形成，最終實現(xiàn)從人工到生物的轉(zhuǎn)化[3]。

絲素蛋白（silk fibroin，SF）是一組具有廣泛生物活性的天然蛋白，來自蠶絲和蛛絲等天然原料，容易獲得且價格低廉。SF在生物技術(shù)、材料科學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物學(xué)以及光電子技術(shù)中都有廣泛應(yīng)用。SF具有良好的生物相容性、可控的生物降解性、良好的氧氣和水蒸氣滲透性、高拉伸強度和低免疫原性等特征，采用不同方法可以將SF加工成凝膠、薄膜、納米纖維、納米顆粒、支架和海綿樣結(jié)構(gòu)等多種形式，發(fā)揮支持、轉(zhuǎn)運和誘導(dǎo)等作用，是理想的組織工程材料[4-6]。本文就近年來SF在骨組織工程中的應(yīng)用進展進行綜述。

1 SF的結(jié)構(gòu)組成決定了其功能多樣性

SF是蠶絲蛋白的核心成分，分子中含有一條重鏈和一條輕鏈，彼此通過二硫鍵連接形成復(fù)合物。重鏈中含有疏水性結(jié)構(gòu)域（主要由酪氨酸和絲氨酸組成），能形成穩(wěn)定的反向平行的β片層晶體；輕鏈中含有親水性更強的氨基酸序列（主要由甘氨酸和丙氨酸組成）。因此，SF具有兩性分子特征（amphiphilic feature）[7]。來自不同物種的SF氨基酸組成存在一定的差異，氨基酸的濃度和排列方式?jīng)Q定了SF的理化性質(zhì)。例如，多聚丙氨酸序列含量高的SF在酸性溶劑中溶解度降低；而含有多聚甘氨酸-丙氨酸序列的SF則具有更多的β片層結(jié)構(gòu)。β片層結(jié)構(gòu)使得SF具有高度的機械強度。研究表明SF的強度要優(yōu)于當(dāng)前已知強度最好的合成材料，如Kevlar?[8]。通過調(diào)節(jié)SF結(jié)構(gòu)中β片層結(jié)構(gòu)含量，可以使SF的降解率在幾小時到幾年的范圍內(nèi)變化。一般來說，隨著β片層濃度的增加，SF降解率降低[9]。據(jù)此可以制備不同生物穩(wěn)定性的SF生物材料，滿足臨床的實際需要。SF表面存在多個修飾位點，可通過不同修飾途徑，使抗體、染料、藥物、熒光物質(zhì)、生長因子、肽和納米顆粒等被融入到SF材料中，形成具有不同表面形態(tài)或信號特征的衍生物，從而改進SF材料與各種細(xì)胞的相互作用。例如，SF氨基功能化可賦予其一定的物理性質(zhì)（如電導(dǎo)性、光學(xué)性質(zhì)和溶解性）以及生物學(xué)功能（如抗菌性、細(xì)胞應(yīng)答和治療作用）?；诶野彼岬闹氐悸?lián)反應(yīng)可以使富含酪氨酸的SF改變表面化學(xué)特征和親水性，促進間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附、增殖和分化[4，7]。除了氨基功能化，SF還能發(fā)生加成、偶聯(lián)、交聯(lián)和共聚合等反應(yīng)。例如，經(jīng)共價修飾將整合素受體識別序列RGD（arginine-glycine-aspartic acid）與SF材料偶聯(lián)，進一步提高細(xì)胞的親和性和增殖活性[10，11]。此外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對SF的氨基酸組成進行特定地遺傳修飾，可以擴展其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用范圍[12]?？梢?，SF的結(jié)構(gòu)特點為研究者提供了更廣闊的操作空間，可以使SF材料在模擬不同硬度、不同降解率以及不同功能的組織中更具靈活性，有利于滿足未來臨床對生物材料功能多樣性的需求。

2 SF在引導(dǎo)骨再生中的作用

引導(dǎo)骨再生（guided bone regeneration，GBR）技術(shù)已被廣泛證明能增加缺損部位宿主骨數(shù)量和質(zhì)量。其原理是用生物相容性材料在骨缺損部位制成屏障，阻擋快速生長的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞侵入骨缺損部位。同時，維持一個隔離的空間為成骨細(xì)胞增殖和新骨形成提供必要的時間[13]。理想的GBR膜應(yīng)具備以下標(biāo)準(zhǔn)：良好的生物相容性、維持一定空間的機械強度、具備成骨作用、適當(dāng)?shù)慕到饴?、臨床可操作性及經(jīng)濟實用。根據(jù)降解性質(zhì)，GBR膜可分為可吸收膜和不可吸收膜。不可吸收膜需要二次手術(shù)取出，會增加感染風(fēng)險和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)?？晌漳じ鶕?jù)材料來源又可分為兩類：合成聚合物，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）和聚己酸內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）；天然聚合物，如膠原蛋白和殼聚糖?？晌漳ぴ隗w內(nèi)可完全降解，減少了患者再次經(jīng)歷手術(shù)過程的不適，但也存在一定的局限性。例如，合成聚合物在體內(nèi)會引起廣泛的宿主免疫反應(yīng)以及術(shù)后腫脹現(xiàn)象，其降解產(chǎn)物通常呈酸性，可能溶解附近的骨組織。天然聚合物的機械強度較差，目前臨床上廣泛應(yīng)用的膠原膜，主要來自牛膠原蛋白，存在感染海綿性腦病等傳染性疾病的風(fēng)險[14]。

性能優(yōu)良的SF具備成為良好GBR膜的潛質(zhì)，故研究者們不斷探討其作為GBR膜的可能性。SF能支持不同細(xì)胞生長，如內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。Yoo等[15]實驗證明了成骨樣細(xì)胞MG63在SF膜上的粘附、增殖和存活。Kim等[16]比較研究了單純SF膜與膠原膜Bio-Gide?在修復(fù)大鼠顱蓋骨缺損模型中的作用。結(jié)果顯示，盡管兩種膜治療組在術(shù)后第8周新骨形成的絕對體積無顯著差異，且均大于無膜處理的對照組，但是在新骨生長速率方面存在一定差異。其中，無膜對照組在2～8周內(nèi)總體較平穩(wěn)，4周后維持相對低的骨再生速率；膠原膜治療組在2～4周中呈現(xiàn)顯著的骨再生，隨后則增長較??；相反，SF膜治療組在2～8周內(nèi)均呈現(xiàn)顯著的生長。Song等[17]為了改進殼聚糖膜的機械強度，通過引入SF制備出殼聚糖/SF-羥磷灰石復(fù)合膜，并比較了該復(fù)合膜與膠原膜Bio-Gide?在新骨形成和愈合效果方面的異同。結(jié)果表明該復(fù)合膜具有成為GBR膜的潛力。除了生物材料本身，制備技術(shù)也是影響膜性質(zhì)和生物相容性的另一重要因素。Lu等[18]首先將蠶絲溶解在氯化鈣甲酸溶液中，維持了蠶絲納米纖維結(jié)構(gòu)（直徑在200～600 nm范圍內(nèi)），然后采用電噴技術(shù)制成SF納米纖維膜。該膜具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑小于平均細(xì)胞大小，能阻止成纖維細(xì)胞的侵入，但允許營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子完成有效的交換；表面積與體積比例增加，可以模擬ECM樣的空間結(jié)構(gòu)，提供細(xì)胞生長所需的環(huán)境。在修復(fù)大鼠顱蓋骨缺損的實驗中，發(fā)現(xiàn)SF納米纖維膜在機械拉伸強度方面優(yōu)于作為對照的Bio-Gide?膜，且第4周時新骨體積和Ⅰ型膠原陽性率高于Bio-Gide?組。因GBR膜的機械穩(wěn)定性是臨床治療成功的重要因素，且降解程度和速率能影響新骨形成，故該研究又比較了SF納米纖維膜與膠原膜Bio-Gide?在體內(nèi)降解的差異。結(jié)果顯示，Bio-Gide?膜在移植后第4周開始出現(xiàn)吸收，到第12周后完全降解；相反，SF納米纖維膜在第12周時仍保持著形態(tài)完整性，為骨再生提供了足夠的空間和時間。

總之，SF能夠作為制備GBR膜的重要生物材料來源，可以通過采用先進的制備技術(shù)對其性能進一步改良，更加滿足理想GBR膜的特征，從而在骨缺損修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

3 SF在復(fù)合材料中的作用

骨是由有機成分和無機成分共同組成的天然復(fù)合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。單純依靠一種類型生物材料實現(xiàn)組織工程修復(fù)骨缺損，往往十分困難。故研究者在探索骨組織工程技術(shù)中，一般設(shè)計構(gòu)建由兩種及以上不同類型成分構(gòu)成的復(fù)合材料，取長補短，改進支架的理化性質(zhì)及功能特點，促進骨再生和骨缺損修復(fù)。SF廣泛而優(yōu)良的特性，使其成為制備復(fù)合材料的重要成分[19-21]。

骨質(zhì)量的70%是由無機成分組成，其化學(xué)本質(zhì)類似于羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）。因此，HA在骨組織工程中應(yīng)用廣泛，常與膠原蛋白、殼聚糖、藻酸鹽（al?ginate，AL）和SF等各種聚合物聯(lián)合制備生物材料支架。Jo等[22]將適當(dāng)質(zhì)量比的SF、AL、和HA混合，經(jīng)塑形、離子交換和干燥后制成復(fù)合顆粒，移植到大鼠顱蓋骨缺損處，觀察該復(fù)合顆粒的生物相容性和成骨作用。結(jié)果表明，相較于對照組，復(fù)合顆粒組在移植后第4周新骨形成明顯增加；在移植后第8周，致炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）呈現(xiàn)較低的表達水平，而成骨標(biāo)志物表達水平則顯著升高；且在移植物周圍組織中未發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)。推測SF的加入刺激了成骨細(xì)胞的增殖和成骨標(biāo)志物的表達，從而有利于成骨分化和新骨再生，且SF在體內(nèi)不會引發(fā)TNF-α分泌和誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)。

為了提高骨組織工程支架的力學(xué)性質(zhì)和強度以及藥物轉(zhuǎn)運能力，Yao等[23]用SF和碳納米管（carbon nano?tubes，CNTs）進一步修飾納米羥磷灰石/聚酰胺66（na?no-hydroxyapatite/polyamide 66，nHA/PA66）支 架表面。支架的疏水性會影響其生物相容性。聚合物的吸水性與分子中化學(xué)鍵的極性有關(guān)。nHA/PA66支架中含有極性較強的PA66，其中的酰胺鍵極性非常強，很容易與水分子形成氫鍵，從而導(dǎo)致支架的高吸水性。吸水性強不利于接種細(xì)胞粘附、增殖和成骨作用形成，從而影響新骨組織的長入。而SF和CNTs則都具有疏水結(jié)構(gòu)，故而SF和CNTs的表面修飾作用會改進nHA/PA66支架的吸水性。該研究結(jié)果顯示SF/CNTs修飾后支架的吸水速率從62.51%減少到49.11%。此外，表面修飾后的nHA/PA66支架在孔隙度方面沒有顯著改變，抗壓強度比修飾前提高了2%。支架的孔隙度和孔徑對于細(xì)胞生長、養(yǎng)料運輸和骨形成非常重要。高孔隙度和特定的表面積能增強接種細(xì)胞的粘附和生長、ECM沉積以及養(yǎng)料和氧氣的轉(zhuǎn)運。而對于骨組織工程支架要求更高，不僅要具備孔狀結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，而且必須具有足夠的機械強度和骨傳導(dǎo)性。要同時兼顧這兩方面往往難度較大，因為孔隙度增加，機械強度勢必降低。Park等[24]則用nHA修飾SF支架表面，希望nHA可以增加支架的硬度并加強SF支架的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性。實驗結(jié)果證明了這一推斷，并發(fā)現(xiàn)該復(fù)合支架在移植后第4周未被吸收，仍維持著缺損空間穩(wěn)定性。由于SF吸收率可通過改變材料孔徑、結(jié)晶度和質(zhì)量分布等進行調(diào)節(jié)，因此可以根據(jù)缺損部位機械性能特點，決定是否選擇SF材料及采用何種加工方法。例如，當(dāng)缺損部位要發(fā)揮皮質(zhì)橋連和長期支持作用時，可優(yōu)先考慮選擇SF支架用于這些負(fù)重較高區(qū)域的修復(fù)。

合成聚合物也是制備骨組織工程支架的重要來源，但其缺點是性質(zhì)不活潑，表現(xiàn)疏水性，缺乏天然的細(xì)胞識別位點。由于SF具備固有的生物活性，能支持細(xì)胞粘附、促進成骨作用及ECM沉積，因此Wang等[25]將不同質(zhì)量的SF加入到由PLA和PCL形成的共聚物PLCL[poly（lactide-co-ε-caprolactone）]中，并采用電噴技術(shù)制成納米纖維結(jié)構(gòu)，嘗試改進合成聚合物PLCL支架的理化性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于單一的PLCL支架組，SF修飾后的PLCL支架組呈現(xiàn)更好的抗拉強度，表面粗糙度和親水性更有利于細(xì)胞粘附和增殖，能夠促進人間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，增強了大鼠顱蓋骨缺損的修復(fù)效果。

上述研究結(jié)果表明SF無論是作為支架的基本組分，還是作為表面修飾材料，均可以利用其獨特優(yōu)勢改進骨組織工程支架的性能。當(dāng)前，制備具有仿生結(jié)構(gòu)和良好生物相容性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性的復(fù)合材料是骨組織工程的研究重點。復(fù)合材料為實現(xiàn)骨組織工程技術(shù)更好的臨床應(yīng)用開辟了更廣闊的新途徑。

4 SF在骨組織工程血管化中的作用

骨是高度血管化組織。在生理狀況下，血管生成先于成骨作用。血管形成是骨組織工程技術(shù)的關(guān)鍵和挑戰(zhàn)[26]。有兩種策略促進組織工程構(gòu)建物的血管形成：一是基于生物材料本身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，通過制成納米纖維結(jié)構(gòu)，模擬天然ECM形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進組織構(gòu)建物的血管形成；二是基于細(xì)胞的策略。該策略可通過預(yù)制血管形成和導(dǎo)入血管生成因子兩種途徑得以實現(xiàn)。前者首先用內(nèi)皮細(xì)胞接種組織構(gòu)建物，然后植入一級宿主體內(nèi)預(yù)制血管形成，最后再植入二級宿主體內(nèi)。后者通過加入促血管生成生長因子或粘附蛋白等蛋白質(zhì)，促進組織愈合和再生。

支架的幾何學(xué)特征和力學(xué)性質(zhì)與骨組織工程的血管形成存在一定關(guān)聯(lián)[27]。Stoppato等[28]在具有三維多孔結(jié)構(gòu)的多聚D，L乳酸（poly-D，L-lactic acid，PDLLA）海綿支架中，引入SF進行修飾，嘗試構(gòu)建能更好地支持內(nèi)皮細(xì)胞定位、促進體內(nèi)血管生成的支架材料。結(jié)果顯示，與單一成分PDLLA支架相比，PDLLA/SF復(fù)合支架的硬度增加，其彈性模量是對照組的2倍，這可能歸因于SF纖維的定向結(jié)構(gòu)決定了支架的機械性質(zhì)。體內(nèi)灌注實驗表明PDLLA/SF組能更早、更快地實現(xiàn)與宿主血管系統(tǒng)完全整合，這應(yīng)歸因于SF中的活性基團支持內(nèi)皮細(xì)胞粘附和生長。Hofmann等[29]首次報道了整合素受體識別序列（RGD）修飾的不同孔徑的SF支架的血管形成能力。研究者設(shè)計制備了小（106～212 μm）、中等（212～300 μm）和大（300～425 μm）三種孔徑SF支架，分別接種間充質(zhì)干細(xì)胞后體外分化成骨樣組織，然后植入小鼠顱蓋骨缺損處，觀察血管形成情況及成骨作用。體外研究顯示成骨作用取決于支架的孔徑大小。其中大孔徑支架組的骨體積和鈣沉積均是最高的，可能歸因于更加開放的結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞穿過和養(yǎng)料供給，從而提高細(xì)胞分化活性。體內(nèi)研究則顯示無論起始孔徑如何，所有的移植物均整合良好，血管形成加強，并開始了骨髓長入。這些體外構(gòu)建的骨樣組織在體內(nèi)能夠發(fā)生重塑，形成不同比例的編織骨/板層骨橋連缺損部位。盡管沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但研究者觀察到中等和大孔徑支架組相對于小孔徑組有更好的血管形成傾向，推測可能小孔徑移植物形成層狀結(jié)構(gòu)或是支架本身在一定程度上阻礙了血管長入。大孔徑支架允許直接的血管形成和成骨作用，而更小孔徑支架可能只是通過軟骨內(nèi)鈣化形成骨樣組織。該研究為體外設(shè)計構(gòu)建不同幾何結(jié)構(gòu)的骨樣組織提供了藍(lán)本。實際上，采用合適的技術(shù)在體外構(gòu)建小梁骨結(jié)構(gòu)是可行的。此外，該研究也顯示RGD序列修飾的SF支架在體內(nèi)產(chǎn)生的炎性反應(yīng)小，并且隨著支架孔徑的增加炎性細(xì)胞數(shù)量減少，可能由于更大的孔隙有利于血管生成，從而可以限制炎性反應(yīng)的發(fā)生和強度。

最新研究表明干細(xì)胞在適當(dāng)強度的材料上可以實現(xiàn)向內(nèi)皮細(xì)胞的分化，而無需引入血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等穩(wěn)定性較差的生長因子和多肽。這為通過調(diào)節(jié)支架強度設(shè)計制備具有血管生成能力的生物材料提供可能性。在制備不溶于水的SF支架過程中，往往伴隨β片層含量增加，會增加支架的機械強度，但對血管生成不利。為了解決這個問題，Han等[30]通過控制蠶絲支架的納米結(jié)構(gòu)和二級構(gòu)象以及調(diào)整蠶絲溶液的pH值，直接制備出具有晶體結(jié)構(gòu)減少的不溶于水的蠶絲支架，軟化了支架的強度。該支架的彈性模量為6 kPa。有研究揭示基質(zhì)的彈性模量在1～7 kPa之間時有利于間充質(zhì)干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞。因此該研究中制備的支架可以為血管形成提供物理信號和有利的微環(huán)境。為了排除納米纖維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞分化的影響，Han等又用不同方法制備了具有類似納米纖維結(jié)構(gòu)但強度更高（12.5 kPa）的SF支架。干細(xì)胞在此高強度支架上不顯示分化成內(nèi)皮細(xì)胞的能力。因此證明了機械性能在誘導(dǎo)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化中的重要作用。

移植后的快速血管化是研究制備組織工程構(gòu)建物的一個難點?？焖俚难苄纬赡鼙苊庖浦参镏行牟课坏膲乃溃⒂欣诔晒羌?xì)胞分化。除了應(yīng)用促血管生成因子外，還可以選擇本身具有促血管生成能力的生物材料（如SF），或者根據(jù)需要設(shè)計具有特定幾何結(jié)構(gòu)和機械強度的材料支架，來協(xié)同促進骨組織工程血管化。

綜上所述，絲素蛋白是機械強度較高的天然聚合物材料，結(jié)構(gòu)中富含易于修飾的活性基團，生物相容性好，生物降解性可調(diào)，機械性能佳，免疫原性低，具有促血管生成能力，是滿足骨組織工程需要的重要生物材料來源。在不斷改進的新型加工技術(shù)的輔助下會呈現(xiàn)出更廣泛的用途，從多方位滿足骨組織工程的需要，為骨組織工程研究提供更廣闊的探索空間。