尹詩(shī)璐 綜述 秦澤蓮 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100191)

意外傷害造成的復(fù)雜大面積創(chuàng)面以及各種疾病導(dǎo)致的慢性難愈性創(chuàng)面往往難以修復(fù)。自體皮片或皮瓣移植是目前整形外科常用的修復(fù)方法，然而供皮區(qū)所形成的新的創(chuàng)面往往帶來(lái)一定的功能及形態(tài)損傷。隨著微創(chuàng)外科理念的廣泛深入，如何通過(guò)最小的創(chuàng)傷達(dá)到最佳修復(fù)效果成為各外科專業(yè)的研究重點(diǎn)及難點(diǎn)。表皮干細(xì)胞研究為大面積皮膚創(chuàng)面的微創(chuàng)修復(fù)提供了新的啟示。提取自皮膚組織的特異性干細(xì)胞，具有自我增殖及分化形成多種皮膚細(xì)胞成分的能力，在皮膚軟組織創(chuàng)面愈合及再生中發(fā)揮重要作用[1,2]。本文對(duì)表皮干細(xì)胞的特點(diǎn)及其在皮膚軟組織創(chuàng)面修復(fù)中的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 表皮干細(xì)胞的特點(diǎn)

1.1 表皮干細(xì)胞的形態(tài)及分布

表皮干細(xì)胞來(lái)源于外胚層，形態(tài)呈鵝卵石形，胞體透亮且排列緊密，主要分布于皮膚基底層及毛囊隆突部位，并且隨個(gè)體年齡和部位不同而有所差異。作為慢周期細(xì)胞，表皮干細(xì)胞的增殖分化受到壁龕(niche)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。壁龕是表皮干細(xì)胞賴以生存的外部微環(huán)境，主要有三種，分別位于表皮細(xì)胞基底層、毛囊隆突部位及皮脂腺基底部[3]。不同的壁龕對(duì)表皮干細(xì)胞的生理狀態(tài)、信號(hào)傳導(dǎo)及分化方向產(chǎn)生不同的影響[1,4,5]。2012年，Dahl[6]的研究顯示，表皮基底層、皮脂腺和毛囊隆突區(qū)域分布有豐富的表皮干細(xì)胞，這些細(xì)胞可分化成不同的皮膚細(xì)胞，替換死亡的表皮、皮脂腺和毛囊細(xì)胞，從而維持皮膚的自我更新及穩(wěn)態(tài)。

1.2 表皮干細(xì)胞的篩選及鑒定

在過(guò)去的10余年中，表皮干細(xì)胞的篩選及鑒定方法得到不斷改善。Ⅳ型膠原快速黏附法是目前常用的篩選表皮干細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法，表皮干細(xì)胞表面高表達(dá)β1整合素，而有絲分裂后細(xì)胞及終末分化細(xì)胞不表達(dá)β1整合素，利用這一特性將細(xì)胞置于預(yù)鋪Ⅳ型膠原的培養(yǎng)皿中，表皮干細(xì)胞依靠其β1整合素能較為快速地與Ⅳ型膠原進(jìn)行黏附而與其他細(xì)胞成分區(qū)分開[7,8]。流式細(xì)胞分選法則利用表皮干細(xì)胞高表達(dá)α6整合素而不表達(dá)CD71的特性，通過(guò)設(shè)立特定的門控通道而高效分選出α6整合素+CD71-的表皮干細(xì)胞[9]。此外，通過(guò)免疫熒光、免疫組化、基因表達(dá)檢測(cè)等方式，檢測(cè)整合素α6、P63、K19等的表達(dá)也是較為常用的表皮干細(xì)胞篩選鑒定方式[7]。除了以上常見的表面標(biāo)志物，也有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用delta樣蛋白1(delta-like protein 1，DLL1)、富含亮氨酸的重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains protein 1，LRIG1)、CD46作為標(biāo)志物進(jìn)行表皮干細(xì)胞的篩選[2,7,10]。

1.3 表皮干細(xì)胞的分化及增殖特點(diǎn)

表皮干細(xì)胞不斷通過(guò)自我分裂及分化維持皮膚的穩(wěn)態(tài)。2001年，Dunnwald等[11]應(yīng)用Hoechest和碘化丙啶熒光染色方法，通過(guò)設(shè)定特定的門控，證實(shí)鼠表皮基底細(xì)胞存在干細(xì)胞[(3.4±0.2)%]、短暫擴(kuò)增細(xì)胞[(89.2±1.1)%]和非增殖細(xì)胞[(7.4±0.9)%]3種不同分化狀態(tài)。在受到特定刺激信號(hào)后，表皮干細(xì)胞不均等分裂形成新的表皮干細(xì)胞及若干短暫擴(kuò)充細(xì)胞，短暫擴(kuò)充細(xì)胞再通過(guò)有限的細(xì)胞分裂形成終末細(xì)胞。由于這3種細(xì)胞增殖能力不同，在體外培養(yǎng)時(shí)分布形成3種不同的細(xì)胞克隆[1]：①全克隆(holoclone)，克隆細(xì)胞集群大而圓，其內(nèi)細(xì)胞成分主要是小而形態(tài)規(guī)則的干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我增殖能力，高表達(dá)β1整合素、K14、P63等細(xì)胞標(biāo)記，可不均等分裂成干細(xì)胞及短暫擴(kuò)增細(xì)胞。②部分克隆(meroclone)，主要由短暫擴(kuò)增細(xì)胞形成，細(xì)胞大小不等，自我增殖及分化能力存在差異，由于在向低分化細(xì)胞分化的過(guò)程中逐漸脫離了干細(xì)胞壁龕環(huán)境，這一細(xì)胞P63的表達(dá)水平明顯低于干細(xì)胞。③次全克隆(paraclone)，克隆面積小且形態(tài)不規(guī)則，其內(nèi)幾乎均為終末分化細(xì)胞，細(xì)胞大而扁平，且高表達(dá)終末分化細(xì)胞標(biāo)記物內(nèi)皮蛋白(involucrin)，通常僅能維持較短的復(fù)制周期，便逐漸喪失增殖能力。

2 表皮干細(xì)胞修復(fù)皮膚軟組織創(chuàng)傷的實(shí)驗(yàn)研究

表皮干細(xì)胞是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)、重建的基礎(chǔ)，在保持皮膚正常結(jié)構(gòu)、維持表皮的自我更新和穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。1984年首次出現(xiàn)應(yīng)用體外培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞治療大面積皮膚燒傷的案例報(bào)道[12]，2例全身燒傷95%以上的患兒(Ⅲ度燒傷面積分別為83%和89%)，應(yīng)用體外培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞成功覆蓋50%以上燒傷創(chuàng)面，同時(shí)挽救了生命。

2.1 表皮干細(xì)胞促進(jìn)急、慢性創(chuàng)面的愈合

創(chuàng)傷可刺激表皮干細(xì)胞增殖分化，形成新的子細(xì)胞填充皮膚組織缺損[13,14]。在基底層完整的情況下，基底層表皮干細(xì)胞逐漸自下而上脫離壁龕，通過(guò)自我增殖分化進(jìn)行創(chuàng)面修復(fù)。若基底層同時(shí)受到破壞，則主要依靠傷口邊緣附屬器內(nèi)的表皮干細(xì)胞向傷口分化、增殖、遷移而進(jìn)行修復(fù)功能[15]。β1整合素是表皮干細(xì)胞進(jìn)行壁龕黏附的重要分子，在創(chuàng)傷早期表皮再生中發(fā)揮重要作用[1]。創(chuàng)傷后，表皮干細(xì)胞的β1整合素消失，使其失去黏附作用向創(chuàng)面移動(dòng)，進(jìn)行分裂啟動(dòng)修復(fù)功能[16]。在移動(dòng)過(guò)程中，新生成的短暫擴(kuò)增細(xì)胞高表達(dá)磷酸化P63，保持增殖功能的同時(shí)繼續(xù)向表面移動(dòng)，填補(bǔ)細(xì)胞空缺，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[13]。1999年，Pellegrini等[17]應(yīng)用富含表皮干細(xì)胞的自體角質(zhì)細(xì)胞移植治療7例20%～45%皮膚全層燒傷，其中6例在移植術(shù)后1個(gè)月創(chuàng)面表皮再生覆蓋達(dá)100%，1例覆蓋達(dá)80%。此外，Mascre等[18]的示蹤研究還顯示表皮干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷組織的修復(fù)和再生起著重要作用，其能在創(chuàng)面基底迅速形成克隆向創(chuàng)面中心擴(kuò)展，僅3.5天，60%干細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了一輪細(xì)胞分裂。同時(shí)證實(shí)表皮干細(xì)胞是創(chuàng)面中長(zhǎng)期發(fā)揮作用的細(xì)胞，(3.8±0.1)細(xì)胞克隆/mm2在移植后35天密度仍可達(dá)(2.6±0.1)細(xì)胞克隆/mm2。

除了大面積燒傷和急性創(chuàng)傷，糖尿病潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面的修復(fù)也是目前表皮干細(xì)胞治療研究的熱點(diǎn)。隨著人口老齡化，肥胖人群增多，糖尿病的患病率逐年增長(zhǎng)，糖尿病潰瘍的發(fā)生率也持續(xù)上升，這類創(chuàng)口往往難以自愈，可遷延數(shù)月甚至數(shù)年?，F(xiàn)有治療方法包括組織工程皮膚產(chǎn)品、局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子、電刺激、負(fù)壓吸引等，都難以達(dá)到滿意效果[13]。2016年，Yang等[19]用糖尿病潰瘍動(dòng)物模型進(jìn)行研究，觀察到表皮干細(xì)胞能夠通過(guò)Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，這一通路中的Jag1能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，應(yīng)用Jag1轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞治療的鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面在15天時(shí)明顯小于未轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞治療的創(chuàng)面。

隨著體外細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，利用表皮干細(xì)胞自我增殖的特性，體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得上皮皮片，移植于創(chuàng)面進(jìn)行修復(fù)，從而彌補(bǔ)了自體皮片供區(qū)不足的缺點(diǎn)。經(jīng)過(guò)不斷的技術(shù)改進(jìn)，自體擴(kuò)增皮片已經(jīng)成為目前治療大面積燒傷皮損及慢性創(chuàng)面的可行手段[2]。2010年，Sood等[20]報(bào)道一項(xiàng)為期18年的臨床研究，對(duì)88例大面積燒傷創(chuàng)面患者進(jìn)行自體擴(kuò)增皮片移植，分別對(duì)其移植存活率、水皰發(fā)生率、創(chuàng)面攣縮發(fā)生率等并發(fā)癥進(jìn)行3～90個(gè)月的隨訪，結(jié)果顯示應(yīng)用這一技術(shù)治療的大面積燒傷患者，總生存率達(dá)91%(80/88)，自體擴(kuò)增皮片移植的成活率高達(dá)72.7%，有66%的患者(58/88)出現(xiàn)創(chuàng)面攣縮，其中32例行攣縮松解手術(shù)。

2.2 表皮干細(xì)胞與皮膚附屬器再生

表皮干細(xì)胞在傷口愈合中的作用不僅僅局限于再生形成分層的表皮，還與毛囊、汗腺等重要皮膚附屬器的再生密切相關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路是汗腺發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中的重要信號(hào)通路，抑制MAPK/ERK通路的磷酸化在表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化過(guò)程中十分重要[21]。在培養(yǎng)基中加入PD98059可阻斷ERK磷酸化，從而抑制MAPK/ERK通路，促使表皮干細(xì)胞退出干細(xì)胞群落，向汗腺細(xì)胞方向分化[22]。同時(shí)，創(chuàng)面底部的表皮干細(xì)胞在創(chuàng)傷刺激下能夠大量分裂增殖并向創(chuàng)面遷移，在增厚的瘢痕乳頭層部位形成毛囊樣結(jié)構(gòu)[23]。有研究表明，創(chuàng)面中心的表皮細(xì)胞具有更大的形態(tài)可塑性，能夠與創(chuàng)面下方的真皮共同作用，參與創(chuàng)面毛囊的再生[24]。2017年，王元元等[25]將體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞接種在組織工程真皮上，加入不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，進(jìn)行三維培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化，通過(guò)HE染色及CK19熒光染色，結(jié)果表明在15～20 ng/ml濃度的EGF誘導(dǎo)下，表皮干細(xì)胞能形成管腔樣結(jié)構(gòu)，該管腔樣結(jié)構(gòu)由單層細(xì)胞構(gòu)成的管壁和中央空腔組成，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)上與在體汗腺分泌部的管狀結(jié)構(gòu)相似，且抗CKl8和抗-CEA免疫熒光染色均表達(dá)陽(yáng)性，從而證實(shí)表皮干細(xì)胞參與創(chuàng)面皮膚附屬器的再生。

2.3 表皮干細(xì)胞與創(chuàng)面瘢痕調(diào)控

表皮干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)面瘢痕的形成過(guò)程產(chǎn)生影響[26]。P63和ki-67的異常表達(dá)與瘢痕形成關(guān)系密切。Edriss等[27]對(duì)瘢痕形成時(shí)期的表皮干細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察到其核蛋白P63和ki-67的表達(dá)明顯增強(qiáng)，證實(shí)其在瘢痕形成過(guò)程中的活性增強(qiáng)。Wang等[28]的研究證實(shí)表皮干細(xì)胞能夠下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)，促進(jìn)堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)及細(xì)胞橋粒形成，與表皮干細(xì)胞共同培養(yǎng)的真皮細(xì)胞外基質(zhì)分布良好，未見膠原束形成，且膠原mRNA和蛋白表達(dá)水平下降至46%，從而減緩皮膚纖維化的進(jìn)程及緩解瘢痕形成。

3 小結(jié)

表皮干細(xì)胞研究的擴(kuò)大及深入，為創(chuàng)面修復(fù)研究提供了新的思路?，F(xiàn)有研究提示我們，具有自我增殖及多項(xiàng)分化能力的表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面覆蓋、皮膚附屬器再生、瘢痕修復(fù)等方面有一定的研究基礎(chǔ)及誘人的應(yīng)用前景。然而目前關(guān)于表皮干細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究仍然十分匱乏，大量的研究仍然停留在基礎(chǔ)層面而缺乏臨床證據(jù)支持。如何將基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，讓表皮干細(xì)胞在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域真正發(fā)揮其作用，仍需更進(jìn)一步的探索。