卞敬琦，馮月男，牛雯穎，肖洪彬

血管出現(xiàn)損傷時，血小板會直接與損傷部位的激活因子相接觸并受到刺激，引發(fā)血小板活化并最終導致血栓形成。病理性血小板異?；罨瘯T導閉塞性血栓的形成，這將增加人們患心臟病及卒中等缺血性疾病的風險。細胞內的信號轉導黏附蛋白及可溶性激動劑是血小板活化的主要因素，它們與血小板膜受體相互作用進而引發(fā)血小板的一系列生理變化。隨著對機體凝血機制研究的不斷深入，越來越多的血小板活化信號通路被證實，近年來又發(fā)現(xiàn)了更為復雜的信號轉導及放大網絡。本文將對這些新發(fā)現(xiàn)的血小板活化信號轉導機制進行概述。

1 血小板活化受體信號通路

1.1 黏附受體介導的血小板活化通路 在高血流量剪切力的作用下，血小板膜表面糖蛋白GPⅠb-Ⅸ-Ⅸ-Ⅴ復合物與血管內皮細胞表面或皮下組織中的血管假性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）結合。該復合物中的配體結合亞基GPⅠbα能夠特異性識別VWF上的A1結構域并發(fā)生偶聯(lián)，該偶聯(lián)使血小板能夠以滾動的方式黏附于受損傷部位。GPⅠb-Ⅸ介導的血小板與VWF的接觸只是暫時的，需要更為穩(wěn)定且持久的偶聯(lián)結構。最新的研究證實，GPⅠbα上一個被稱作機械敏感通路的區(qū)域在VWF依賴的拉力作用下會發(fā)生延展［1］。而GPⅠbα上的另一個亮氨酸重復結構同樣會在VWF的介導下發(fā)生構象變化［2］，這些構象變化不僅能夠增強血小板與VWF之間的穩(wěn)定性，還可以使細胞內鈣離子含量提升，促進血栓形成［3］。GPⅠb-Ⅸ與凝血酶的結合對于低劑量下凝血酶誘導的血小板活化具有重要影響。該機制普遍適用于凝血物含量較低的凝血過程，而該過程對體內血栓的形成同樣至關重要［4］。

免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）是免疫細胞活化相關受體胞漿區(qū)所共有的、以酪氨酸殘基為基礎的氨基酸序列，其中酪氨酸是蛋白激酶的磷酸化位點，磷酸化后能夠與信號轉導途徑下游的信號分子結合，對白細胞的激活起著重要作用［5］。整合素以及GPⅠb-Ⅸ雖然與ITAM受體有關，但它們的信號轉導卻不以ITAM的信號通路為主，ITAM的作用主要體現(xiàn)在受體信號放大上［6］。位于人血小板上的ITAM受體亞基，如Fc受體γ鏈（FcRγ）與其對應的位于免疫球蛋白IgG上的FcγRⅡa受體的結合會導致人血小板對抗原抗體復合物以及聚集免疫球蛋白的應答。ITAM受體除了對血小板與白細胞信號傳輸有影響外，其對血小板的活化作用也是近年來研究的熱點。ITAM與膠原受體（GPVI）信號傳導有關，而膠原受體是血小板活化、黏附過程的重要元件。研究表明，GPVI與FcRγ形成的非共價復合物與一些特殊的家族激酶，如Lyn有關聯(lián)，然而GPVI與Lyn的關系至今仍存在爭議。一些研究者認為Lyn在GPIV介導的ITAM信號轉導方面具有拮抗作用，其抑制了配對免疫蛋白受體B在ITAM信號轉導通路中的促進作用［7］。此外，活性氧對于ITAM的信號放大作用同樣具有重要影響［8］。

1.2 模式識別受體介導的血小板活化通路 病原相關模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和損傷相關模式分子（damageassociated molecular patterns，DAMPs）是組織或細胞受到損傷、缺氧、應激等因素刺激后釋放到細胞間隙或血液循環(huán)中的一類成份。PAMPs與DAMPs可通過 Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）樣受體、糖基化終末產物受體（RAGE）等模式受體實現(xiàn)先天免疫及非感染性炎癥應答的初始信號轉導。最新的研究表明，TLRs和NOD均與促進血小板活化有關［9］。血小板表面分布有幾種 TLRs，如 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 以及TLR9。研究表明，TLR2可在TLR1-/TLRs-特異性受體激動劑以及脂質衍生物的誘導下活化血小板［10］。TLR9則在氧化應激的過程中調節(jié)了血小板活化信號的傳導。TLR4是血小板主要的脂多糖受體，其可促進血小板顆粒的釋放與活化，且TLR4介導了髓樣分化因子依賴的環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G血小板活化通路［11］。由模式識別受體引發(fā)的血小板活化很可能是機體針對微生物感染及組織損傷的炎性反應，已經有研究證明血小板活化與血栓形成對機體感染期間出現(xiàn)的敗血癥及動脈粥樣硬化具有重要影響［12］。

1.3 可溶性血小板受體激動劑介導的G蛋白偶聯(lián)血小板活化 血管損傷處釋放的可溶性受體激動劑與血小板膜表面特異性受體的結合是血小板活化的關鍵。這些特異性受體絕大多數(shù)是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）。GPCR 家族是一組擁有7個跨膜域結構的膜蛋白，該受體的細胞內信號轉導主要依靠其配體系統(tǒng)。與配體結合的GPCR會發(fā)生構象變化，從而表現(xiàn)出鳥苷酸交換因子的特性，三磷酸鳥苷（GTP）與G蛋白上固有的二磷酸鳥苷（GDP）的交換使得α亞基與β、γ亞基分離，G蛋白隨即變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并參與下一步的信號傳遞過程，而具體的傳遞通路則取決于α亞基的種類。典型的G蛋白亞基Gαi及Gαs，其偶聯(lián)受體分別為P2Y12與前列腺素受體PTGIR。Gαi及Gαs均可與腺苷酸環(huán)化酶結合，Gαs會通過刺激腺苷酸環(huán)化酶而促進腺苷酸的合成，Gαi則會抑制該反應。最新研究表明，腺苷酸可利用其依賴的腺苷酸蛋白激酶使血小板保持穩(wěn)定狀態(tài)，而Gαi可通過拮抗抑制血小板合成的第二信使（環(huán)腺苷酸）達到激活血小板的目的［13］。

1.4 血小板激活途徑不同受體之間的協(xié)同作用 一些血小板激活劑存在多個血小板受體，最佳的血小板活化途徑常常需要多個受體通路的協(xié)同作用。二磷酸腺苷（ADP）是一種由血小板顆粒及受損細胞釋放出的血小板激活劑，其需在Gαq偶聯(lián)的P2Y1及Gαi偶聯(lián)的P2Y12共同信號作用下活化血小板。血凝素誘發(fā)的血小板活化網絡較為復雜，在血小板表面至少有3種血凝素受體：人源的血小板膜糖蛋白（PAR）1、PAR4和GPⅠb-Ⅸ以及鼠源的血小板膜糖蛋白PAR3、PAR4和GPⅠb-Ⅸ。研究證實，在血凝素的刺激作用下，PAR1會通過與PAR4形成異源二聚體的形式增強PAR4的裂解［14］。研究表明，PAR4與P2Y12形成的異源二聚體促進了信號的傳遞，進而導致與血小板激活相關蛋白激酶的活化［15］，針對于P2Y12的治療則可有效預防血小板的異?；罨?6］。在血小板活化機制中，GPⅠb-Ⅸ會促進血凝素的分解，或者作為一個獨立的血小板活化信號，因此GPⅠb-Ⅸ的作用一直存在爭議。最近的研究結果表明，GPⅠb-Ⅸ既不是一個被動的血凝素識別位點，也不是PAR-依賴的血凝素受體，但血凝素誘導的GPⅠb-Ⅸ信號轉導與PAR信號的協(xié)同作用是血小板應答的最佳方式［4］。這些不同受體的協(xié)同作用極大地增強了血小板對血凝素濃度的敏感性，該機制對動脈血栓的形成極為重要［4］。

2 信號放大網絡

2.1 磷脂酶C、鈣調節(jié)及甘油二脂（DAG） 磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）是大多數(shù)血小板活化信號通路的整合中心。血小板表達了至少3種不同的PLC––PLCβ、PLCγ以及PLCδ。在人的血小板中，PLCγ2 的含量高于 PLCβ2 并均高于 PLCβ3，且PLCβ與PLCγ擁有不同的激活機制，PLCβ受Gαq的影響，而PLCγ則受酪氨酸激酶介導的酪氨酸磷酸化的調控。然而最新的研究成果表明，Gαq偶聯(lián)的受體激動劑也會通過活性氧介導的信號通路誘導PLCγ的磷酸化［17］。PLC的主要功能之一是催化45-磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）分解為DAG和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。IP3與IP3受體的結合使得Ca2+從復雜的管狀系統(tǒng)釋放到胞質內，該過程是凝血過程中Ca2+升高的主要機制。細胞內Ca2+濃度的升高在血小板活化過程中扮演了重要角色，其同時也是大部分細胞進行信號傳導的重要方式之一。DAG可活化常規(guī)（α、β）及特殊（δ、θ、η、ε）的蛋白激酶 C（PKC）同系物，這些同系物在整合素激活及血小板顆粒釋放過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明Ca2+濃度的增加促進了Ca2+與DAG調控相關鳥嘌呤核苷酸傳遞因子Ⅰ（CalDAG-GEFⅠ）的釋放［18］。盡管 CalDAGGEFⅠ上僅存在一個低親和力的DAG結合位點，但并不排除其參與了CalDAG-GEFⅠ的活化過程［19］。

2.2 磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K）通路 PI3K通路是誘導血小板顆粒釋放、激活及黏附的重要信號放大網絡。在眾多磷酸肌醇成員中，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）主要由4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）在Ⅰ型PI3K的作用下轉變而來。受體激動劑激活PI3K并產生PIP3，PIP3能夠與3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1（PDK1）及其蛋白激酶亞型PIP3受體位點結合，進而導致PDK1磷酸化及蛋白激酶活化。在血小板中，蛋白激酶B（Akt）共含有3種異形體，敲除任何一種都會導致血凝素含量降低以及凝血惡烷A2類似物誘導的血小板活化減弱［20］。一氧化氮合成酶（NOS）與糖原合成酶激酶3（GSK3β）是2種蛋白激酶效應因子，它們被證實可以調節(jié)PI3K激酶的信號轉導，導致血小板顆粒的分泌及活化。研究表明，GSK3β在不同的血小板活化途徑中扮演了不同的角色，首先其可以抑制血凝素誘導的血小板活化，但在膠原蛋白誘導的血小板活化過程中，GSK3β 似乎又能起到促進作用［20］。然而 GSK3β的活化機制目前尚不清楚。最新的研究表明，PI3K家族的第二類成員PI3KC2α對血栓在血流中形態(tài)的保持發(fā)揮了重要作用［21］。此外，PI3K家族的第三類成員PI3K vps34可通過影響氮氧化物的組裝調節(jié)血小板活性且與血小板的自噬有密切關系［22］。

2.3 血小板環(huán)鳥苷酸（cGMP）信號通路新概念 cGMP在cGMP依賴的蛋白激酶（PKG）活化過程中扮演了重要角色。血小板激動劑能夠刺激cGMP含量的升高，且外源性cGMP類似物的刺激也會對血小板產生影響。早期對于由NO誘導的可溶性環(huán)鳥苷酸的研究表明，NO-cGMP通路能夠有效抑制血小板的活化，但幾乎全部的擬cGMP藥物并不能有效抑制血小板的生理功能。直到最近，這一概念受到了NO-cGMP-PKG雙向信號傳導研究的挑戰(zhàn)。研究人員發(fā)現(xiàn)，血小板活化過程中高濃度的NO及cGMP會抑制血小板的活化，而細胞內部早期合成的低濃度NO及cGMP則可以促進血小板的活化過程，且能夠顯著增加血小板對激動劑的敏感度［23］，該血小板活化cGMP-PKG通路模式識別受體的重要作用已被多個研究小組成功證實［24］。

2.4 類花生酸通路 類花生酸作為第二信使為血小板活化傳遞信號，成員包括前列腺素類、凝血惡烷類和白細胞三烯類等。類花生酸的合成需要鈣離子依賴的細胞溶質磷脂酶A2（PLA2）的活化，其可以水解磷脂膜釋放花生四烯酸（AA）。研究表明，AA是通過環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶途徑進行代謝的［25］。COX 可以將 AA 轉化為前列腺素（PG）［26］。血小板合成的幾種PG中凝血酶A2（TXA2）是一種有效的血小板激動劑，其在增強血小板活性方面起著重要作用，TXA2與血小板偶聯(lián)受體Gq-/G13-的結合可以促進血栓的形成。

2.5 顆粒物分泌介導的信號放大 血小板活化過程中最常見的信號放大機制是血小板顆粒的分泌。血小板含有3種主要分泌細胞器：含有小分子的δ顆粒、含有黏附蛋白的α顆粒以及含有降解酶的溶酶體［27-28］。已分泌的血小板顆粒不僅能夠增強血小板活化信號，還可以激活處于休眠狀態(tài)的血小板，該機制極大地促進了血栓的形成。此外，分泌出的顆粒物有助于血管損傷及炎癥的修復，當然也不可避免地增加了病理性動脈粥樣硬化及血液中癌細胞的擴散。血小板顆粒釋放的關鍵機制是顆粒膜與血小板及開放微管系統(tǒng)中原生質膜的融合，該融合使得血小板顆粒釋放到胞外環(huán)境中。隨著血小板連續(xù)的收縮，大量的顆粒被源源不斷地釋放出來，該過程受到N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白（NSF）、可溶性NSF連接蛋白（SNAP）以及可溶性NSF連接蛋白受體（SNAREs）的調控［27-28］。細胞內 Ca2+濃度的升高及SNARE的磷酸化在某種程度上也刺激了顆粒物的分泌。幾乎所有的血小板激動劑都會刺激血小板顆粒的分泌，如膠原蛋白和血凝素等“強”激動劑會直接誘導血小板顆粒的分泌及聚集。相比之下，一些“弱”激動劑，如ADP或者低濃度的“強”激動劑需要在整合素等外源信號的介導下才能激活顆粒的分泌。目前已證實的與促進血小板顆粒分泌相關的因子及信號通路包括：（1）鈣離子濃度。（2）PKC信號通路。（3）Src家族激酶信號通路。（4）PI3K/AKT 及NO/cGMP/PKG信號通路。（5）絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。（6）CalDAG-GEFI與 Rap1b信號通路。（7）RhoGTPase Rac1與RhoA信號通路。這些通路的作用機制尚不明確，仍需進一步研究證明。

3 展望

血小板活化信號在血小板誘導的血栓形成中發(fā)揮了重要作用，多年來一直是研究者關注的焦點。相比于傳統(tǒng)的血小板活化概念，一些新出現(xiàn)的更為龐大且復雜的血小板信號激活及放大網絡越來越受到人們的關注。這些新理論的出現(xiàn)不僅使研究者對血小板活化機制有了更深入的認識，同時也對傳統(tǒng)理論發(fā)起了嚴峻的挑戰(zhàn)。借助于動物模型技術的發(fā)展以及創(chuàng)新型藥物的研究，更多的血小板活化信號轉導機制將被闡明，血小板相關生理學領域的研究也將取得長足進步。

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