盧堅+孫家麒

摘要 通過單因素實驗建立1種乙醇提取銀杏雄球花黃酮的方法。采用有機試劑乙醇浸提得銀杏雄球花乙醇提取物，測定其總黃酮含量，并對影響銀杏雄球花總黃酮提取的乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)5個因素進行單因素試驗，優(yōu)化提取條件。結果表明，在乙醇濃度80%、液料比1∶10、溫度50℃、提取時間30min、提取2次時，黃酮得率較高，為1.8%。

關鍵詞 銀杏；雄球花；黃酮；提?。粶y定

中圖分類號 TS201.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）24-0241-02

Extraction and Determination of Flavonoids from Male Cones of Ginkgo biloba L.

LU Jian 1 SUN Jia-qi 2

（1 Chengdu Yulin High School，Chengdu Sichuan 611130； 2 College of Agronomy，Sichuan Agriculture University）

Abstract A method of ethanol extraction of flavonoids from male cones of Ginkgo biloba L.was established by single factor experiment.The ethanol extract of male cones of Ginkgo biloba L.was extracted with organic reagent ethanol to determine the content of total flavonoids.The concentration of ethanol，the ratio of liquid to material，the extraction temperature，the extraction time and the number of extraction were determined.The extraction conditions were optimized.The results showed that when the concentration of ethanol was 80%，the ratio of liquid to material was 1∶10，the temperature was 50 ℃，the extraction time was 30 min and the extraction time was twice，the yield of flavone was 1.8%.

Key words Ginkgo biloba L.；male cone；flavonoids；extraction；determination

銀杏（Ginkgo biloba L.）是我國較常見的觀賞樹種，栽種范圍廣，屬銀杏科、銀杏屬的落葉喬木[1]。目前已有較多關于銀杏果實和葉的研究[2-3]，果實含多種營養(yǎng)物質，是極佳的滋補品，味美養(yǎng)生。而對銀杏葉的研究發(fā)現(xiàn)其含有各種生物活性成分，如酚酸、黃酮類和萜類等[4-6]。正因如此，銀杏葉便有了不同的生物學功能。銀杏樹每年春季開花，在這期間會有不少的銀杏雄球花從樹上掉落，作為銀杏樹的一部分卻被廢棄，造成資源浪費。因此，試驗將以銀杏雄球花為材料，從植物中常含有的生物代謝產(chǎn)物黃酮著手，研究銀杏雄球花黃酮的提取及含量，以期為銀杏雄球花這一資源的利用做相關基礎研究。本研究以乙醇為浸提液，以黃酮得率為考察指標，通過單因素試驗，初步建立一種乙醇提取銀杏雄球花黃酮的方法。

1 材料與方法

1.1 試材與儀器

供試材料為銀杏雄球花，4月采自四川農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)。

主要試劑為蘆?。绹鳶igma-Aldrich公司）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器有FW-100型高速粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、DK-8D型三孔電熱恒溫水槽（上海齊欣科學儀器有限公司）、SC-04型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）、1800/1600 UV系列紫外可見分光光度計（翱藝儀器（上海）有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀杏雄球花黃酮的提取和測定。具體包括以下內(nèi)容。

（1）樣品處理。將采集的銀杏雄球花在105 ℃下烘10 min，隨后再以60 ℃烘至恒重，粉碎，過篩，得到銀杏雄球花干粉。

（2）蘆丁標準曲線的制作。蘆丁標準溶液為100 μg/mL。參考文獻[7]方法，取蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%NaOH 4.0 mL，用60%乙醇定容至10 mL。測定A510值，并繪制標準曲線。

（3）樣品總黃酮提取及含量的測定。稱取樣品2.0 g，按60 ℃、料液比1∶10加入60%乙醇溶液，浸提30 min，6 000 r/min離心，收集上清液，定容至50 mL，得到40 mg/mL（w/v）的銀杏雄球花乙醇提取液。量取一定濃度的銀杏雄球花乙醇提取液，按上述蘆丁測定方法檢測吸光值A510，由蘆丁標準曲線求得的回歸方程推算銀杏雄球花中的黃酮含量。

1.2.2 影響銀杏雄球花黃酮得率的單因素試驗。具體有以下內(nèi)容。

（1）乙醇濃度。設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，分別稱取銀杏雄球花干粉2.0 g，加入不同濃度乙醇溶液10 mL（即料液比為1∶10），60 ℃水浴，每30 min搖晃1次，提取2 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液，并定容至50 mL，測定提取液黃酮含量。endprint

（2）料液比。稱取銀杏雄球花干粉2.0 g，按不同的料液比加入80%乙醇，其他提取條件不變，提取2 h，同樣方法離心，定容，測定提取液黃酮含量。

（3）提取溫度。以上述方法改變提取溫度，固定其他條件，考察溫度對銀杏雄球花黃酮得率的影響。

（4）提取時間。同理固定其他條件，改變提取時間，測定不同提取時間下黃酮得率。

（5）提取次數(shù)。在其他條件不變的情況下，料液比按1∶10進行浸提，分別收集第1次以及逐次將沉淀再按料液比1∶10浸提后的上清液，進而測定不同提取次數(shù)的黃酮得率。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁作為標準品，按相關文獻方法，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線（圖1），得回歸方程：y=0.001 6x-0.006，R2=0.999 5。通過一定濃度的銀杏雄球花乙醇提取液在類似方法下測定，計算銀杏雄球花總黃酮含量為1.8%。

2.2 影響銀杏雄球花黃酮提取的單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度。在其他因素不變的情況下，乙醇濃度為變量，測定乙醇濃度對銀杏雄球花黃酮得率的影響，結果見圖 2。乙醇濃度對黃酮得率有明顯的影響，隨著乙醇濃度的改變，黃酮得率發(fā)生變化，乙醇濃度在30%～80%之間時，黃酮得率隨乙醇濃度升高而加大，繼續(xù)增加乙醇濃度黃酮得率則下降。可以看出，在乙醇濃度為80%時，黃酮得率最高。

2.2.2 料液比。設置不同的料液比，考察料液比改變對銀杏雄球花黃酮得率的影響，結果見圖3。可以看出，料液比的改變對黃酮得率有顯著的影響，當料液比為1.0∶2.5、1∶5、1∶10 時，黃酮得率相差不大，但料液比為1∶15～25時黃酮得率則表現(xiàn)為明顯的下降趨勢，在測定范圍內(nèi)，料液比為1∶10時，黃酮得率最大。

2.2.3 提取溫度。以提取溫度為變量，其他因素固定不變，考察提取溫度對銀杏雄球花黃酮得率的影響，結果見圖4。可以看出，提取溫度的改變對黃酮得率有影響，但影響不大，在測定范圍內(nèi)，當提取溫度為50℃，黃酮得率最大。

2.2.4 提取時間。改變提取時間，其他條件不變，檢測提取時間對銀杏雄球花黃酮得率的影響，試驗結果見圖5。可以看出，提取時間對黃酮得率的影響較小。

2.2.5 提取次數(shù)。以提取次數(shù)為變量，固定其他條件，將銀杏雄球花干粉經(jīng)首次浸提，離心，定容，測定黃酮含量，記為第1次，再將沉淀按相同方法浸提，記為第2次，以此類推。測定結果見圖6。結果表明，隨著提取次數(shù)的增多，黃酮得率迅

速降低，提取到第3次時黃酮得率極低。

2.3 銀杏雄球花黃酮含量

根據(jù)試驗分析結果，選擇試驗范圍內(nèi)銀杏雄球花黃酮的最適宜條件，即稱取銀杏雄球花干粉2 g，料液比1∶10，乙醇濃度80%，溫度50 ℃，浸提30 min，以6 000 r/min離心10 min，取上清液，再往沉淀加入80%乙醇20 mL，按前述方法重復浸提1次。收集并合并2次上清液定容至50 mL，測定銀杏雄球花黃酮含量，經(jīng)推算，銀杏雄球花黃酮含量為1.8%。

3 討論

銀杏雄球花作為銀杏樹的一部分，每年春季開花期間會有部分自然脫落，由于現(xiàn)今銀杏樹栽種數(shù)量多，而這些掉下的銀杏雄球花卻不被利用。因此，本試驗以銀杏雄球花為材料，嘗試測定本植物材料中的生物活性成分黃酮的含量，并進一步探索用有機試劑乙醇提取的適宜條件，以黃酮得率為指標，考察了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)5個因素對銀杏雄球花黃酮提取的影響。由試驗結果分析可知，除提取時間外，乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取次數(shù)對提取的黃酮得率均有影響，但影響程度不一樣。其中乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)的影響較大，表現(xiàn)出較強的相關性，最終分析確定該方法以乙醇濃度80%、料液比1∶10，提取溫度50 ℃、提取時間30 min和提取2次為宜，在此基礎上測得銀杏雄球花黃酮含量為1.8%。研究結果揭示，銀杏雄球花可通過乙醇在一定條件下浸提獲得生物活性成分黃酮，這對銀杏雄球花的開發(fā)利用具有重要意義。

4 參考文獻

[1] 曹福亮.中國銀杏[M].南京：江蘇科學技術出版社，2002.

[2] 楊強，李新華，王琳，等.銀杏果多糖的物化性質及抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013（10）：2395-2400.

[3] 汪素娟，康安，狄留慶，等.銀杏葉提取物主要活性成分藥動學研究進展[J].中草藥，2013（5）：626-631.

[4] 劉平平，潘蘇華.銀杏葉制劑中銀杏酚酸研究進展[J].中國中藥雜，2012（3）：274-277.

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[6] 劉彬果，張新萍，劉巖.銀杏葉中萜內(nèi)酯類化合物的研究進展[J].藥學實踐雜志，2011（6）：421-425.

[7] 陳志紅，徐美奕.香菜乙醇提取液的體外抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（11）：69-71.endprint