, ,,懷志,*

(1.廈門華廈學院檢驗科學與技術(shù)系,福建廈門 361024; 2.廈門大學薩本棟微米納米科學技術(shù)研究院,福建廈門 361005; 3.廈門市普識納米科技有限公司,福建廈門 361005)

食品安全已成為全民共同關(guān)注的主要問題,完善的樣品處理及檢測技術(shù)可以幫助我們及時發(fā)現(xiàn)食品安全中存在的問題。目前,針對不同樣品缺乏最佳的處理及檢測方式,使得對所檢樣品準確、可靠的監(jiān)測和控制不能完全實現(xiàn)。因此,開發(fā)出準確、便捷的食品樣品處理和檢測技術(shù)對保障食品安全意義重大[1-2]。

羅丹明B(Rhodamine B,RB)是一種人工合成的三苯甲烷類堿性染料,曾經(jīng)用作食品添加劑,根據(jù)國際癌癥研究署(IARC)化學品致癌風險評價實驗證明RB具有潛在的毒性和致癌性[3],目前我國和歐盟等都嚴禁在食品中添加,是近些年來食品中重點監(jiān)測的非法添加劑[4]。但因其具有色澤鮮艷[5]、著色穩(wěn)定[6]、價格低廉[7]等特點,常被一些不法商家非法用作食品著色劑(以辣椒制品為主),嚴重危害了消費者的健康。目前,在中國還沒有關(guān)于羅丹明B檢測的國家標準,也沒有快速檢測標準,只有進出口食品中羅丹明B的檢測標準[8]。主要檢測方法是提取后經(jīng)凝膠色譜凈化,再用HPLC和HPLC-MS聯(lián)用法進行檢測[8]。該處理系統(tǒng)價格昂貴,過程繁瑣,應(yīng)用設(shè)備多,所需有機溶劑復雜,且檢測時間長,很難普及,更不適用于現(xiàn)場快速檢測。在快速檢測方面,有根據(jù)固相萃取原理開發(fā)出來的快速檢測法[9-10],但該法主要是根據(jù)肉眼觀察固相萃取柱上的紅色條帶進行判斷,易出現(xiàn)假陽性,準確度低,檢測靈敏度也不高。

激光技術(shù)的出現(xiàn)使拉曼光譜檢測方式在分析化學等很多領(lǐng)域中得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用。表面增強拉曼光譜(SERS)是近年來發(fā)展起來的一項高靈敏度振動光譜檢測技術(shù),借助于納米金屬基底的表面等離激元誘導的表面電磁場的增強效應(yīng),SERS可將待測物的信號放大6～10個數(shù)量級[11-12],在食品科學和材料科學等領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[13-14]。

本實驗提出了一種以納米金溶膠為拉曼信號增強模塊,結(jié)合SERS快速分析的特點,利用自制的樣品前處理儀與便攜式拉曼光譜檢測儀,實現(xiàn)對辣椒制品、臘肉、果汁、葡萄酒等食品中羅丹明B的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

散裝辣椒粉、海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬,實驗編碼為L0～L4；廣東風味臘腸和天鑼香腸,實驗編碼為R1、R2；果繽紛、貝奇野菜以及長城干紅葡萄酒,實驗編碼為G1～G3；以上材料均購自廈門生鮮超市；氯金酸(HAuCl4)、檸檬酸鈉、正己烷等實驗中所用試劑 分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司;羅丹明B標準品 上海國藥集團化學試劑有限公司;水溶液皆用超純水(Millipore)配制;金納米粒子(自制);pers-A1增強助劑 廈門市普識納米科技公司。

自制SERS前處理儀 與廈門市普識納米科技公司合作研發(fā)),如圖1所示:儀器由超聲池、揮發(fā)池、離心裝置以及控制系統(tǒng)構(gòu)成。揮發(fā)池同時具有加熱揮發(fā)和抽氣揮發(fā)兩種功能,即可以提高揮發(fā)度,又能通過抽氣方式增加空氣流動,對揮發(fā)出來的萃取劑進行迅速抽離;自帶離心裝置,可以現(xiàn)場對少量樣品進行快速離心;控制系統(tǒng)可以實現(xiàn)對超聲時間、抽氣時間、加熱溫度等的控制；便攜式拉曼光譜儀 美國Dalt Nu公司;HITACHI S-4800型掃描電鏡 Hitachi公司;Waters 2695E液相色譜儀(帶熒光檢測器) 美國Waters 公司;UV-3600紫外可見分光光度計 日本島津公司。

圖1 自制SERS前處理儀Fig.1 Appearance of the homemade SERS

1.2 金納米溶膠的制備及表征

利用檸檬酸鈉還原HAuCl4的方法[15]合成金納米溶膠。制備過程如下:將1.2 mL質(zhì)量分數(shù)為1.0%的檸檬酸鈉迅速加入到含有1 mmol/L HAuCl4的100 mL沸水溶液中,同時劇烈攪40 min,得到棕紅色納米金溶膠。取兩份適量金溶膠,一份進行紫外可見光譜(UV/Vis)分析，掃描延長為400～800 nm;另一份在5500 r/min室溫條件下離心分離10 min,棄去上清液至剩余約5 μL左右的濃縮金納米粒子,后用超純水稀釋10倍,用移液槍移取5 μL滴加在準備好的硅片上,真空抽干,進行電鏡(SEM)掃描。

1.3 羅丹明B標準溶液配制

準確稱取羅丹明B標準品適量,加入無水乙醇溶解,配成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準儲備液。再分別準確量取適量儲備液,用水稀釋成所需濃度的標準溶液。

1.4 樣品前處理及羅丹明B的提取

1.4.1 辣椒粉及其相關(guān)制品類固體調(diào)味品的前處理方法 分別稱取1.0 g海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬于提取劑瓶中,加入10 mL超純水,放置于便攜式快速前處理儀超聲處理模塊,超聲頻率40 kHz,功率為60 W,超聲振蕩1 min,取上清液于分離管中,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標準溶液,之后向溶液中加入4 mL的正己烷進行萃取,將分離管放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干,待測。

1.4.2 肉制品的前處理方法 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纖維中,利用水進行提取,提取效率低,故采用正己烷作為提取劑,其余操作條件同1.4.1。分別取1.0 g廣東風味臘腸和天鑼香腸樣品,經(jīng)超聲提取后,上清液置于分離管中,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標準溶液,放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干后待測。

1.4.3 果汁、葡萄酒等液體樣品的前處理方法 分別量取4 mL果繽紛、貝奇野菜以及長城干紅葡萄酒于分離管中,加入8 mL正己烷萃取,平行三份,依據(jù)檢測要求分別加入0.5、1.0 mg/kg的羅丹明B標準溶液,將分離管放置于便攜式快速前處理儀揮發(fā)模塊進行加熱吹干后待測。

1.4.4 前處理方法對比 為了驗證自制快速處理儀器的提取性能,本實驗也進行了自制前處理儀與常規(guī)樣品處理方法的對比。其中,實驗室常規(guī)提取方法的具體流程[16-17]為:

稱取1.0 g樣品→經(jīng)超聲提取(30 ℃,10 min)→離心(室溫,5500 r/min 5 min)→正己烷萃取(4 min)→靜置分層(11 min)→氮吹(10 min)→超純水重新溶解(0.5 mL)→即得到提取液。

1.5 拉曼光譜分析

取400 μL上述待測樣品,加入20 μL金納米溶膠,再加入20 μL pers-A1增強助劑,混勻后迅速在便攜式拉曼光譜儀上進行檢測。該儀器的激光波長為785 nm,激光功率為60 mW,激發(fā)時間少于5 s,掃譜范圍為200～1800 cm-1。

1.6 液相色譜分析

取1.4.4所得辣椒粉樣品提取液,離心后取上清液過0.45 μm微孔濾膜后,采用液相色譜測定。色譜條件:流動相A:0.1%甲酸乙腈,B:0.1%甲酸溶液;0 min:A 20%;5.0 min:A 50%;8.0 min:A 50%;8.1 min:A 20%;15 min:A 20%。色譜柱:Symmetry Shield RP 4.6 mm×250 mm,185 μm,流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:Ex 550 nm,Em 580 nm;進樣體積:5.0 μL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

因為光源輸出功率的穩(wěn)定性、樣品不同添加濃度等因素會引起拉曼信號的偏差,影響檢測結(jié)果的準確性。因此,本實驗選擇羅丹明B的一個穩(wěn)定特征峰(1355 cm-1)為內(nèi)標信號,采用內(nèi)標法定量。將羅丹明B的另外三個特征峰(620、1510、1645 cm-1)與內(nèi)標峰比值作為相對強度,以相對強度作為加標不同濃度的羅丹明B溶液的響應(yīng)值進行歸一化計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 自制金粒子溶膠表征

取適量1.2中自制金納米溶膠進行UV/Vis和SEM分析,結(jié)果如圖2所示,從UV/Vis(圖2A)圖可以看出,在550 nm附近有一個明顯的吸收峰對應(yīng)50 nm左右金納米粒子的特征吸收峰;而由SEM(圖2B)則可以得知合成的金納米粒子顆粒較為均勻,大小在45～50 nm之間,與紫外可見光譜結(jié)果一致。

圖2 自制金納米粒子的紫外-可見吸收光譜及SEM電鏡圖Fig.2 UV/Vis and SEM diagram of Au colloid 注:A為紫外-可見吸收光譜, B為SEM電鏡圖(40.0 k×)。

2.2 辣椒粉經(jīng)常規(guī)前處理和快速法處理的SERS結(jié)果對比

從圖3可以看到,兩種處理方法得到的樣品在620、1355、1510、1645 cm-1處都出現(xiàn)了羅丹明B的特征拉曼峰。其中,620 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)氧雜蒽環(huán)的面內(nèi)振動模式,1355 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)苯環(huán)上的C-C單鍵的彎曲振動,1510 cm-1處的拉曼峰對應(yīng)苯環(huán)上C-H單鍵的彎曲振動,而1645 cm-1附近的拉曼峰則對應(yīng)苯環(huán)上的C-C單鍵的彎曲或C=C雙鍵的伸縮振動模式。兩種處理方法對于SERS譜圖的影響差異并不明顯。另外,用常規(guī)方法處理辣椒粉,整個過程需要大約40～45 min,而用自制的快速前處理儀進行樣品處理只需要大約10 min,時間上縮短了3/4,大大提高了檢測效率。

圖3 羅丹明B實驗室常規(guī)處理方法與快檢法SERS對比圖Fig.3 SERS spectrum of Rhodamine B with the instrument and the pretreatment methods注:a:自制前處理儀(約10 min);b:常規(guī)方法(40～45 min)。

2.3 不同辣椒制品中各種成分的干擾實驗

2.3.1 不同辣椒制品中RB的SERS檢測 為保證檢測結(jié)果的有效性,實驗同時進行羅丹明B標準品、空白樣品和加標樣品的對比測定,結(jié)果如圖4所示。通過對市面上不同品牌的辣椒調(diào)味品進行測試發(fā)現(xiàn):未添加標準羅丹明B的辣椒制品(空白樣品)的SERS曲線(圖4中所有e曲線),在200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),基本上為無特征信號的背景曲線,說明空白樣品中不含RB成分;而對比羅丹明標準品的SERS譜圖可以看到,加標0.2 mg/kg濃度的RB后的樣品SERS曲線在620、1355、1510、1645 cm-1處出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,而且隨著羅丹明B加標溶液質(zhì)量濃度的增大,拉曼峰強度也隨著增強,說明檢測出了羅丹明B的存在。這表明本實驗方法能對這些成分復雜多樣的辣椒制品中所含痕量羅丹明B進行高靈敏度的快速檢測,同時不受不同的樣品成分的干擾。本方法對辣椒制品的檢測具有普適性,而且檢測低限可達到0.2 mg/kg。

圖4 不同成分辣椒制品中羅丹明B SERS譜圖Fig.4 SERS spectrum of Rhodamine B in chilli products注:L1～L4分別為海堤特級辣椒醬、海堤泰式甜辣醬、愛之味酸辣醬和壇壇鄉(xiāng)精制剁椒醬。

2.3.2 SERS和常規(guī)液相色譜方法對比實驗 為了驗證快速檢測方法的可行性,實驗選取了辣椒粉及其制品經(jīng)快速前處理儀提取后,進行SERS和常規(guī)液相色譜兩種方法檢測,結(jié)果如表1所示。

表1 實際辣椒粉樣品及辣椒制品的SERS及LC兩種方法檢測結(jié)果對比Table 1 Determination results of the chilli samples

由表1可以看出,除了散裝辣椒粉中含有微量羅丹明B以外,其他辣椒制品中均不含該成分,兩種檢測結(jié)果真實可信且無明顯差異,說明本實驗方法可用于各種辣椒制品中羅丹明B的現(xiàn)場篩查或?qū)嶒炇翌A(yù)檢。

2.4 其他食品中羅丹明B的檢測

2.4.1 肉制品中羅丹明B的檢測 由于在肉制品中,色素主要吸附于肉制品的纖維中,利用水進行提取,提取效率低,低濃度情況下無法檢出,而且在1 mg/kg時信號也比較微弱。因此,本實驗直接采用正己烷提取臘肉及其他肉制品中的羅丹明B,結(jié)果如圖5所示。由圖5中可知,未添加標準羅丹明B的肉制品(空白樣品)的SERS譜圖(d曲線)中,200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),基本上依然是無特征信號的背景曲線,說明兩種肉制品中不含羅丹明B成分;當添加0.5 mg/kg及以上濃度的標準羅丹明B溶液時,SERS譜圖在了620、1355、1510、1645 cm-1附近明顯出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,能夠輕易地分辨出該臘肉等制品中是否添加了羅丹明B。本實驗方法可成功實現(xiàn)對臘腸中羅丹明B的檢測,而且最低檢測濃度可達0.5 mg/kg。

圖5 肉制品中羅丹明B的SERS譜圖 Fig.5 SERS spectrum of Rhodamine B in Bacon and its products注:R1、R2分別為廣東風味臘腸和天鑼香腸。

2.4.2 果汁及葡萄酒中羅丹明B檢測 為了驗證方法的普適性,實驗還對果汁、葡萄酒等進行快速檢測。由于SERS具有指紋圖譜特點,所以葡萄酒類樣品無需任何前處理。以加標0.5、1 mg/kg羅丹明B樣品及標準溶液進行對比,結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看到,所有d曲線在200～1800 cm-1區(qū)間內(nèi),空白樣品基本為無特征信號的背景曲線,說明這幾種果汁、酒品中不含羅丹明B;而加標0.5 mg/kg濃度后的譜圖上可以清楚看到在620、1355、1510、1645 cm-1附近出現(xiàn)了羅丹明B的尖銳特征峰,說明檢測到RB的存在,而且隨著加標溶液質(zhì)量濃度的增大,強度也隨著增強。綜上可知,對于含量高于0.5 mg/kg羅丹明B的樣品,可以根據(jù)拉曼譜圖中特征譜峰位置和相對強度確定樣品中是否含有羅丹明B成分。

通過上述各種食品中RB的檢測實驗可以看出,本方法適用于不同品種、不同成分的樣品檢測,結(jié)果準確可靠、方法可行,最低檢測濃度可以達到0.5 mg/kg。

2.5 回收率實驗

以加標辣椒粉樣品中羅丹明B的測定為例,在100、200、300 μg/L 3個添加水平下,采用內(nèi)標法進行定量,以被測物的特征峰為內(nèi)標信號,即以羅丹明B在1355 cm-1的特征峰進行歸一化計算,添加平均回收率分別為82.4%、87.0%和81.1%,相對標準偏差RSD分別為2.1%、3.0%和2.2%。由此可見,本方法的準確度良好,滿足樣品快速分析的要求。

3 結(jié)論

本實驗基于納米金溶膠表面增強拉曼光譜技術(shù),利用自主研發(fā)的拉曼前處理儀和便攜式拉曼檢測儀實現(xiàn)了對辣椒及其制品,以及其他食品如果汁、葡萄酒中羅丹明B的現(xiàn)場快速檢測。樣品的分析時間由常規(guī)的40～50 min縮短到約10 min,同時達到0.5 mg/kg的最低檢出濃度,以RB在1355 cm-1處的特征峰為內(nèi)標信號進行歸一化計算,在100、200、300 μg·L-1三個添加水平下,得到其平均回收率在81.1%～87.0%之間,相對標準偏差RSD在2.1%～3.0%范圍內(nèi)。本檢測方法幾乎涵蓋了行業(yè)標準《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》中主要檢測對象,而且樣品前處理簡單,耗時少,檢測結(jié)果準確可靠,且儀器設(shè)備便攜、易操作,可用于食品中羅丹明B的現(xiàn)場篩查或?qū)嶒炇翌A(yù)檢,有望彌補國內(nèi)現(xiàn)有食品行業(yè)標準中關(guān)于羅丹明B的檢測空白。

[1]Sun D f,Wang G X,Qian S S,et al. Review on testing technologies and standards for food safety[J]. China Measurement and Test,2015,41(8):1-7.

[2]Soylak M,Unsal Y E,Yilmaz E,et al. Determination of rhodamine B in soft drink,waste water and lipstick samples after solid phase extraction[J]. Food and Chemical Toxicology,2011,49(8):1796-1803.

[3]尹峰,丁召偉,楊志堅.固相萃取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測香辛料中羅丹明B[J].色譜,2012,30(7):672-676.

[4]Liang F H,Jin D H,Ma P Y,et al. Rapid Determination of Rhodamine B in Chili Powder by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy[J]. Analytical Letters,2015,48(12):1918-1929.

[5]Oplatowska M,Elliott C T. Development and validation of rapid disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Methyl Yellow and Rhodamine B dyes in foods[J]. Analyst,2011,136(11):2403-2410.

[6]Lu Q G,Gao W,Du J J,et al. Discovery of Environmental Rhoda-mine B Contamination in Paprika during the Vegetation Process[J]. Agric Food Chem,2012,60(19):4773-4778.

[7]Gupta V,Mohan D,Sharma S,et al. Removal of basic dyes(Rhodamine B and methylene blue)from aqueous solutions using bagasse fly ash[J]. Sep Sci Tech,2000,35(13):2097-2113.

[8]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T 2430-2010進出口食品中羅丹明B的檢測方法[S].北京:中國標準出版社,2010.

[9]薛昆鵬,金小青,余沖,等.固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定辣椒制品中羅丹明 B[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學,2016,7(6):2375-2380.

[10]李小燕,李梅,陳其鋒,等. 固相萃取-高效液相色譜檢測葡萄酒中羅丹明B[J]. 食品科學,2011,32(8):238-243.

[11]Tian Z Q,Ren B,Wu D Y. Surface-enhanced Raman scattering:from noble to transition metals and from rough surfaces to ordered nanostructures[J]. J Phys Chen B,2002,106(37):9463-9483.

[12]Tian Z Q. Surface-enhanced Raman spectroscopy:advancements and applications[J]. J Raman Spectroscopy,2005,36(6/7):466-470.

[13]Li J F,Huang Y F,Ding Y. Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J]. Nature,2010,464(7287):392-395.

[14]Sun C H,Wang M L,Feng Q,et al. Surface-enhanced Raman scattering(SERS)study on Rhodamine B adsorbed on different substrates[J]. Russ J Phys Chem A,2015,89(2):291-296.

[15]FRENS G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Phys Sci,1973,241:20-22.

[16]Mishra K P,Gogate P R. Intensification of degradation of Rhodamine B using hydrodynamic cavitations in the presence of additives[J]. Separation and Purification Technology,2010,75:385-391.

[17]Oplatowska M,Elliott C T. Development and validation of rapid disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of Methyl Yellow and Rhodamine B dyes in foods[J]. The Analyst,2015,136:2403-2410.