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(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門(mén) 361021;2.廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門(mén) 361021)

鮑魚(yú)是一種單殼軟體動(dòng)物,營(yíng)養(yǎng)豐富,在中國(guó)、日本、韓國(guó)以及東南亞等國(guó)家被視為名貴的海珍品之一。我國(guó)近年來(lái)鮑魚(yú)產(chǎn)量猛增,2015年產(chǎn)量已突破12萬(wàn)噸,其中福建省的產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的79%[1]。由于鮑魚(yú)養(yǎng)殖較集中,鮮活鮑魚(yú)不易長(zhǎng)途運(yùn)輸,需要加工成產(chǎn)品供應(yīng)全國(guó)各地,因此有必要對(duì)鮑魚(yú)肌肉的成分和熱特性進(jìn)行深入探究,為鮑魚(yú)的熱加工工藝改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

腹足肌肉是鮑魚(yú)的主要可食部分,其蛋白主要由肌原纖維蛋白和膠原蛋白組成[2]。Olaechea Porturas等[3]發(fā)現(xiàn)100 g日本三浦半島皺紋盤(pán)鮑肌肉裙邊中含有7.83 g膠原蛋白,明顯高于閉殼肌。肖桂華等[4]在研究大連皺紋盤(pán)鮑肌肉組織結(jié)構(gòu)時(shí),發(fā)現(xiàn)裙邊的膠原纖維較多,肌纖維較少,硬度較大。Gao等[5-8]考察了蒸、煮等熱加工工藝對(duì)鮑魚(yú)肌肉的流變學(xué)特性和組織結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)引起肌原纖維蛋白的變性、膠原蛋白的明膠化,結(jié)果導(dǎo)致鮑魚(yú)肌肉流變性質(zhì)發(fā)生變化。因此,鮑魚(yú)不同部位的肌肉組成及其熱特性可能存在一定的差異,但這方面的研究卻鮮有報(bào)道。

南日鮑是皺紋盤(pán)鮑與日本盤(pán)鮑雜交所得的品種,個(gè)體大、耐高溫,在南日島海域可以全年養(yǎng)殖,具有體肥殼艷,鮑肉細(xì)嫩,味道鮮美獨(dú)特,接近野生等特征,于2007年獲得中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[9-10]。本研究以南日鮑為研究對(duì)象,考察了鮑魚(yú)腹足肌肉貝柱、過(guò)渡和裙邊三個(gè)部位的基本成分、氨基酸組成、蛋白組分分布、微觀組織結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱變性溫度,為南日鮑的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活的南日鮑 6月份購(gòu)買(mǎi)于廈門(mén)市東月嶼海洋食品有限公司;鮑魚(yú)肌原纖維蛋白 由集美大學(xué)水產(chǎn)品加工研究室提供;過(guò)碘酸雪夫氏(PAS)染色試劑盒 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;鹽酸、硫酸、戊二醛、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等試劑 分析純,西隴化工股份有限公司。

Sigma 3-18k高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Q2000差示掃描量熱儀 美國(guó)TA儀器公司;Samdri-PVT-3D臨界點(diǎn)干燥儀 美國(guó)Tousimis公司;E-1010離子濺射儀、S-480掃描電子顯微鏡 日本日立制造所;Nicolet iS50傅立葉紅外光譜分析儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮑魚(yú)樣品前處理 將鮑魚(yú)肌肉表面粘液刷洗干凈,去殼去內(nèi)臟,將鮑魚(yú)肌肉按圖1劃分為貝柱、過(guò)渡和裙邊三個(gè)部位,分別進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定。

圖1 鮑魚(yú)肌肉部位的劃分Fig.1 Division of abalone muscle注:A:貝柱部位;B:過(guò)渡部位;C:裙邊部位。

1.2.2 基本成分的測(cè)定 水分含量的測(cè)定采用GB/T 5009.3-2010直接干燥法;蛋白含量的測(cè)定采用GB/T 5009.5-2010凱氏定氮法,蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25;糖含量的測(cè)定采用GB/T 15672-2009苯酚硫酸法;脂肪測(cè)定采用GB/T 14772-2008索氏抽提法;灰分含量測(cè)定采用GB/T 5009.4-2010高溫灼燒法。

1.2.3 氨基酸組成的測(cè)定 參考Park等[11]報(bào)道的氨基酸測(cè)定方法,取一定量的鮑魚(yú)肌肉樣品放在消化管中,加入1 mL 6 mol/L HCl及20 μL苯酚,充氮?dú)饷芊夂笾糜?10 ℃下水解22 h,水解液趕酸后用0.02 mol/L鹽酸溶解,過(guò)0.22 μm聚醚砜膜,再用鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)進(jìn)行柱前衍生,最后利用高效液相色譜儀測(cè)定氨基酸組成。色譜條件:色譜柱為Zorbax Eclipse-AAA分析柱,柱溫為40 ℃,流動(dòng)相A為40 mm Na2HPO4(pH7.8),流動(dòng)相B為乙腈-甲醇-水(體積比為45∶45∶10),流速為2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)分別為338 nm和262 nm。

1.2.4 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 鮑魚(yú)不同部位的肌肉利用2% SDS-8 mol/L尿素-20 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)的蛋白變性劑均質(zhì)溶解后,經(jīng)離心(10000 r/min,15 min,20 ℃),上清液利用SDS-PAGE進(jìn)行分析。電泳樣品用4%的濃縮膠,12%的分離膠在8 mA的電流下進(jìn)行電泳后,分別用考馬斯亮藍(lán)染色和PAS染色對(duì)鮑魚(yú)肌肉蛋白和糖蛋白進(jìn)行分析。

1.2.5 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察 參考Weng等[12]報(bào)道的處理方法,將鮑魚(yú)肌肉切成2～3 mm正方體塊狀,在4 ℃下用含2.5%的戊二醛的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)固定24 h后,用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.2)清洗3次,再經(jīng)過(guò)乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水和CO2臨界點(diǎn)干燥儀干燥,用離子濺射儀鍍金后,最后利用SEM對(duì)鮑魚(yú)肌肉縱切面微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 鮑魚(yú)不同部位的肌肉切成均勻的薄片,利用傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行掃描,波長(zhǎng)范圍為4000～1000 cm-1,光譜分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)16次。

1.2.7 差示掃描量熱儀(DSC)分析 利用DSC對(duì)鮑魚(yú)不同部位肌肉的熱轉(zhuǎn)變溫度(Tm)進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg的新鮮鮑魚(yú)肌肉放入坩堝中,以空坩堝作為參比。樣品先分別在40、50、60 ℃下保溫10 min,然后以1 ℃/min升溫至90 ℃,同時(shí)以直接降溫的樣品和鮑魚(yú)肌原纖維蛋白作為對(duì)照。利用DSC配套分析軟件對(duì)DSC曲線進(jìn)行分析,鮑魚(yú)肌肉的Tm為吸熱峰所對(duì)應(yīng)的峰值溫度。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每組數(shù)據(jù)至少測(cè)定3個(gè)平行,結(jié)果取平均值。采用SPSS17.0軟件和Microsoft Excle 2003進(jìn)行分析,顯著性檢驗(yàn)方法為Duncan多重檢驗(yàn),檢測(cè)限為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分

表1顯示了鮑魚(yú)不同部位肌肉的基本成分。由表1可以看出鮑魚(yú)的貝柱、過(guò)渡和裙邊部位肌肉的水分含量依次增加,而蛋白、總糖和脂肪含量卻出現(xiàn)下降趨勢(shì)。此外,貝柱和過(guò)渡部位的灰分含量明顯低于裙邊部位。肖桂華等[4]研究大連皺紋盤(pán)鮑的性質(zhì)時(shí),也發(fā)現(xiàn)鮑魚(yú)肌肉裙邊部位的糖含量遠(yuǎn)低于其它部位。表1的結(jié)果還表明了鮑魚(yú)是一種富含蛋白和糖、低脂肪的貝類(lèi)食品。

表1 鮑魚(yú)不同部位肌肉的基本成分Table 1 Proximate compositions in the different parts of abalone muscle

注：同行肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05),表2同。

2.2 氨基酸組成

表2是鮑魚(yú)不同部位肌肉的氨基酸組成。鮑魚(yú)三個(gè)部位肌肉的氨基酸總量變化趨勢(shì)與蛋白含量變化趨勢(shì)(表1)一致。在貝柱部位,谷氨酸含量最高,其次是精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和甘氨酸,而胱氨酸含量最低。過(guò)渡部位的鮑魚(yú)肌肉氨基酸組成與貝柱部位類(lèi)似,但與裙邊部位肌肉存在明顯的差異。裙邊部位肌肉的谷氨酸、組氨酸、精氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸和賴(lài)氨酸含量顯著低于其他部位,而甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量顯著高于其他部位。據(jù)報(bào)道,甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分,其中羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸,占膠原蛋白的10.2%[3,13-14]。因此,根據(jù)表2的結(jié)果可知南日鮑裙邊部位的膠原蛋白占肌肉的10%左右,明顯高于其他部位。

表2 鮑魚(yú)不同部位肌肉的氨基酸組成Table 2 Amino acid compositions in the different parts of abalone muscle

2.3 SDS-PAGE

圖2是鮑魚(yú)不同部位肌肉的SDS-PAGE圖譜。當(dāng)電泳分離的蛋白條帶經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后,發(fā)現(xiàn)貝柱和過(guò)渡部位的肌肉蛋白分布基本一致,均在40 kDa和100 kDa附近出現(xiàn)兩個(gè)顏色較深的蛋白條帶,以及200 kDa附近高分子組分,表明鮑魚(yú)貝柱和過(guò)渡部位的肌肉主要是由肌動(dòng)蛋白(Actin)、副肌球蛋白(PM)和肌球蛋白重鏈(MHC)等組成。這與Konieczny等[15]報(bào)道的河蚌肌肉蛋白組成類(lèi)似。然而,在鮑魚(yú)肌肉裙邊部位中Actin和PM條帶顏色明顯變淺,卻在150 kDa附近出現(xiàn)一些連續(xù)分布的蛋白條帶(圖2),這可能是裙邊部位的膠原蛋白[14,16]。當(dāng)?shù)鞍讞l帶經(jīng)PAS染色后,貝柱和過(guò)渡部位均在35、40、50、100 kDa處出現(xiàn)四條紅色的糖蛋白條帶。然而,在裙邊部位只有在40 kDa和100 kDa處出現(xiàn)兩個(gè)糖蛋白條帶。這個(gè)結(jié)果不僅暗示鮑魚(yú)裙邊部位糖蛋白含量低,與表1的結(jié)果相吻合,還表明鮑魚(yú)肌肉多糖主要與PM和小分子蛋白結(jié)合。

圖2 鮑魚(yú)不同部位肌肉的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of different parts of abalone muscle注:M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1:貝柱部位;2:過(guò)渡部位;3:裙邊部位。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

圖3 鮑魚(yú)不同部位肌肉的掃描電鏡圖譜Fig.3 SEM-micrographs of different parts of abalone muscle

圖2是鮑魚(yú)不同部位肌肉的SEM圖,從圖2中可以發(fā)現(xiàn)鮑魚(yú)的貝柱、過(guò)渡和裙邊部位肌肉的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸變得致密,尤其裙邊部位出現(xiàn)塊狀和束狀聚集。這種差異可能與鮑魚(yú)腹足吸附和運(yùn)動(dòng)功能有關(guān)[17],鮑魚(yú)肌肉無(wú)骨骼支撐,因此需要依靠精細(xì)的肌肉纖維結(jié)構(gòu)來(lái)完成各種動(dòng)作[18]。Olaechea Porturas等[3]在研究鮑魚(yú)肌肉硬度與膠原含量關(guān)系時(shí),也發(fā)現(xiàn)鮑魚(yú)的閉殼肌(貝柱部位肌肉)主要由肌原纖維組成,而接近裙邊的腹足肌肉主要由富含膠原蛋白的結(jié)締組織組成。Voltzow 等[19]在研究海洋螺類(lèi)的結(jié)構(gòu)形態(tài)時(shí),也發(fā)現(xiàn)螺肉腹足的纖維結(jié)構(gòu)比貝柱部位更細(xì)。

2.5 FTIR分析

蛋白質(zhì)和多糖在紅外光譜中均具有獨(dú)特的指紋特征[20],因此利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對(duì)鮑魚(yú)不同部位肌肉進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4所示。在鮑魚(yú)貝柱肌肉的FTIR圖譜中,可以看到明顯的酰胺A,酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰。鮑魚(yú)過(guò)渡部位肌肉的FTIR圖譜與鮑魚(yú)貝柱肌肉類(lèi)似,而裙邊的酰胺Ⅱ吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng),并出現(xiàn)了酰胺Ⅲ吸收峰。據(jù)報(bào)道,酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ均代表N-H彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)[21],但前者主要是N-H彎曲振動(dòng),后者主要是C-N伸縮振動(dòng)[22]。而且,酰胺Ⅱ的吸收峰容易受側(cè)鏈氨基酸的影響[23]。因此,圖4的結(jié)果表明鮑魚(yú)的貝柱和過(guò)渡部位在二級(jí)結(jié)構(gòu)上相似度較高,而裙邊部位蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈氨基酸可能與其他部位不同,結(jié)果導(dǎo)致FTIR的酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ吸收峰出現(xiàn)明顯的差異。

圖4 鮑魚(yú)不同部位肌肉的FTIR圖譜Fig.4 FTIR spectra of different parts of abalone muscle

2.6 DSC分析

圖5 鮑魚(yú)肌原纖維蛋白和不同部位肌肉的DSC圖譜Fig.5 DSC thermograms of different parts of abalone myofibrillar protein and abalone muscle 注:a:貝柱部位;b:過(guò)渡部位;c:裙邊部位; 對(duì)照:未經(jīng)加熱變性樣品。

為探究鮑魚(yú)不同部位肌肉的熱特性,利用差示掃描量熱儀測(cè)定了鮑魚(yú)肌原纖維蛋白和肌肉的Tm,結(jié)果如圖5所示。在鮑魚(yú)肌原纖維蛋白DSC曲線中含有兩個(gè)吸熱峰,類(lèi)似于Paredi等[24]報(bào)道扇貝肌原纖維蛋白的DSC曲線,分別代表肌球蛋白和副肌球蛋白的疊加變性峰和肌動(dòng)蛋白的變性峰。由圖5a可以發(fā)現(xiàn),在未加熱變性的鮑魚(yú)貝柱部位肌肉的DSC曲線中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)放熱峰和兩個(gè)吸熱峰。然而,當(dāng)貝柱部位肌肉經(jīng)過(guò)40 ℃加熱后,DSC曲線中放熱峰消失而出現(xiàn)了三個(gè)吸熱峰。隨著加熱溫度的提高,低于加熱溫度的吸熱峰逐漸消失。鮑魚(yú)肌肉過(guò)渡部位的DSC曲線(圖5b)與貝柱部位類(lèi)似,而裙邊部位肌肉(圖5c)只在51 ℃附近出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰。由于裙邊主要是由膠原蛋白組成,因此51 ℃附近的吸熱峰代表了鮑魚(yú)膠原蛋白的變性峰。有研究報(bào)道羅非魚(yú)肌肉DSC曲線的放熱峰可能是由于肌肉三磷酸腺苷(ATP)快速水解的緣故[25]。而且,鮑魚(yú)的貝柱和過(guò)渡部位的ATP含量顯著高于裙邊部位[26]。因此,鮑魚(yú)貝柱和過(guò)渡部位肌肉的DSC曲線出現(xiàn)放熱峰,而在裙邊部位肌肉沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。圖5的結(jié)果還表明了鮑魚(yú)肌肉的最大變性溫度在71 ℃附近,因此圍繞該溫度開(kāi)展鮑魚(yú)熱加工工藝的優(yōu)化,將可以防止采用過(guò)高加熱溫度使鮑魚(yú)膠原蛋白明膠化[27-28],避免營(yíng)養(yǎng)流失。

3 結(jié)論

南日鮑腹足肌肉的水分含量從貝柱到裙邊依次增加,而蛋白、多糖和脂肪含量卻逐漸減小。鮑魚(yú)貝柱和過(guò)渡部位肌肉主要由肌原纖維蛋白組成,在氨基酸組成、蛋白和糖蛋白的分布、二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱特性方面基本一致,而鮑魚(yú)裙邊富含膠原蛋白,肌肉纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密,但熱變性溫度低。因此,在鮑魚(yú)熱燙預(yù)處理中需要控制熱燙溫度和熱燙時(shí)間,今后將圍繞在70 ℃附近開(kāi)展鮑魚(yú)熱加工工藝改良研究。

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