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(1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002; 2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

植物抗菌活性蛋白,是植物抵御外界病原菌的一種物質(zhì),可抑制真菌的生長(zhǎng)甚至殺死真菌[1]。植物在自然環(huán)境下生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中,隨時(shí)會(huì)遭受各種病原菌的侵染,隨著植物體的進(jìn)化發(fā)展,植物體本身逐漸形成了一套天然的防御系統(tǒng),能夠在植物體內(nèi)合成一些物質(zhì)來(lái)抵抗外源病菌,抗真菌活性蛋白就是植物抵御外界病原菌的一種物質(zhì)[2-3]?？咕鞍淄ㄟ^(guò)抑制真菌生理代謝活動(dòng)、降解真菌細(xì)胞壁、破壞真菌細(xì)胞膜、破壞細(xì)胞的核糖體及降解細(xì)胞中的核酸來(lái)保護(hù)植物體免受病原菌的浸染[4-5]。目前,對(duì)于抗菌生物活性蛋白的分離、活性表征、作用機(jī)理都有一定程度的探究[6-7],但相關(guān)理論及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的研究還有待進(jìn)一步深入,隨著植物生物活性蛋白研究的深入,其應(yīng)用范圍將會(huì)更廣泛。

小紅豆,是豆科類(lèi)的一年生直立草本植物,種皮呈深紅色,故又被稱(chēng)為紅小豆、赤豆、紅赤豆等。我國(guó)是小紅豆的原產(chǎn)地和出口大國(guó),而且小紅豆?fàn)I養(yǎng)豐富,口感細(xì)膩,廣受人們的喜愛(ài),被譽(yù)為糧食中的“紅珍珠”[8]。據(jù)報(bào)道,每100 g小紅豆中約含蛋白質(zhì)21.7 g,蛋白質(zhì)含量達(dá)22.65%,比大米的蛋白質(zhì)含量高2～3倍[9-10]。此外,小紅豆還具有較高的藥用價(jià)值,對(duì)糖尿病、高血壓、肝硬化、冠心病等現(xiàn)代高頻性疾病具有較好的輔助療效[11-12]。已有相關(guān)報(bào)道從紅豆中分離純化出具有抗惡性細(xì)胞增殖活性的多肽及HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[15]。而從豆科植物中開(kāi)發(fā)新的抗真菌活性蛋白應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)以及基因工程等方面具有重大意義。目前,已有從黑豆[13]、花生[14]中分離得到植物抗真菌蛋白的報(bào)道,而小紅豆中的抗真菌蛋白未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在從小紅豆中分離純化一種抗真菌蛋白,并對(duì)其生物活性進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小紅豆 福州永輝超市;尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) 福建省農(nóng)科院;Affi-gel Blue gel親和色譜填料 日本TOSOH公司;Sephadex SP C-25陽(yáng)離子交換色譜填料 英國(guó)Amersham Biosciences公司;Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜填料 美國(guó)GE Healthcare;其余化學(xué)試劑均為分析純。

XZ-21K型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;FD-1C-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV/V-16/18型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;MINI PROTEIN Ⅱ電泳儀 美國(guó)BIO RAD公司;超凈工作臺(tái) 美國(guó)Thermo Forma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗真菌蛋白的分離與純化

1.2.1.1 粗提液的制備 取25 g小紅豆種子,加入適量的蒸餾水浸泡24 h,使豆子吸水完全膨脹后取出去皮,加入250 mL NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行勻漿,經(jīng)紗布過(guò)濾,除去殘?jiān)?收集濾液。濾液在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,收集上清液即為小紅豆蛋白的粗提液。

1.2.1.2 硫酸銨分級(jí)沉降 向蛋白質(zhì)粗提液中加入固體硫酸銨,按標(biāo)準(zhǔn)的硫酸銨飽和度配制表計(jì)算添加至其飽和度達(dá)到20%,磁力攪拌充分溶解后,于4 ℃靜置4 h,然后在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,收集上清液。繼續(xù)向上清液中加入硫酸銨至其飽和度達(dá)80%,溶解后于4 ℃靜置4 h,在4 ℃、10000 r/min下離心20 min,取沉淀物,用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液溶解沉淀,并用同樣的緩沖液充分透析,截留規(guī)格3500 Da,在4 ℃溫度下透析48 h,其間每8 h換一次透析液,即得到初分離樣品。

1.2.1.3 親和色譜純化 將透析后的樣品在4 ℃溫度下12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,去除沉淀,獲得的上清液上樣到已用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液平衡的Affi-gel Blue gel親和色譜柱中,并用同樣的緩沖液洗去未吸附的蛋白(在280 nm下測(cè)定洗出液吸光值,小于0.05為洗滌終點(diǎn)),再用含0～1 mol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,10 min/管,檢測(cè)280 nm下的吸光值。

1.2.1.4 離子交換色譜純化 將洗脫峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行透析,截留規(guī)格3500 Da,在4 ℃溫度下透析48 h,其間每8 h換一次透析液,離心后取上清液上樣到已用同樣緩沖液平衡好的Sephadex SP C-25陽(yáng)離子交換色譜柱,洗去未吸附蛋白后(在280 nm下測(cè)定洗出液吸光值,小于0.05為洗滌終點(diǎn)),用含0～1 mol/L NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫,流速為0.5 mL/min,10 min/管,檢測(cè)280 nm下的吸光值。

1.2.1.5 凝膠過(guò)濾色譜純化 將洗脫峰收集后用NaAc-HAc(20 mmol/L,pH5.4)緩沖液進(jìn)行透析,濃縮后在-50 ℃下凍干成粉末,用去離子水進(jìn)行溶解,過(guò)0.22 μm的膜后用于凝膠過(guò)濾色譜。Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜用去離子水平衡,上樣結(jié)束后去離子水進(jìn)行洗脫,直至洗出液在280 nm的吸光值小于0.05即認(rèn)定所有蛋白都被洗出。

1.2.2 SDS-PAGE 采用Laemmli方法[15],不連續(xù)電泳體系(12.5%分離膠,4%濃縮膠),起始電壓100 V,到達(dá)分離膠后電壓升至120 V,考馬斯亮藍(lán)染色。由相對(duì)遷移率計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.3 蛋白含量的測(cè)定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),采用Lowry方法測(cè)定樣品蛋白含量[16]。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.0065X+0.0143,R2=0.9972。

1.2.4 抗菌蛋白抑菌活性的測(cè)定 采用瓊脂片擴(kuò)散法[17],真菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基,菌種采用來(lái)自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢鐮刀菌。將受試菌分別接種于培養(yǎng)基平板中央,放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待菌落直徑長(zhǎng)至4 cm左右時(shí),在距菌落邊緣0.5 cm處貼上無(wú)菌濾紙片(直徑6.25 mm),并分別滴加8 μL濃度為40、20 μg/μL的抗菌蛋白溶液,將平板置于30 ℃中恒溫培養(yǎng),觀察其抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中所有數(shù)據(jù)均取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 小紅豆抗真菌蛋白的分離純化

經(jīng)過(guò)緩沖液抽提、硫酸銨沉降后獲得的粗體液經(jīng)Affi-gel Blue gel親和色譜進(jìn)行純化,在280 nm下測(cè)量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖1所示。通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)得洗脫峰A2具有抗真菌活性,收集并合并A2峰組分。

圖1 小紅豆抗真菌蛋白的Affi-gel Blue gel親和色譜圖Fig.1 Affinity chromatography of the antifungal protein from small red beans on Affi-gel Blue gel

圖2 小紅豆抗真菌蛋白的Sephadex SP C-25離子交換色譜圖Fig.2 Ion exchange chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex SP C-25

親和色譜洗脫峰A2組分的成分經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后仍比較復(fù)雜,經(jīng)透析后上樣到離子交換色譜Sephadex SP C-25柱中。在280 nm下測(cè)量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖2所示。在平衡液條件下沒(méi)有掛柱,直接被沖洗下來(lái)的峰稱(chēng)為穿透峰,被洗脫液洗脫下來(lái)的峰稱(chēng)為洗脫峰。由圖2可知,親和色譜洗脫峰A2經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜后,得到一個(gè)穿透峰S1和兩個(gè)洗脫峰S2、S3,通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn),測(cè)得洗脫峰S3具有抗真菌活性,收集并合并S3峰組分。

離子交換色譜洗脫峰S3組分經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后,出現(xiàn)兩條分子量相差較大的電泳條帶,S3組分經(jīng)透析、凍干濃縮后,用去離子水溶解,并上樣到凝膠過(guò)濾色譜Sephadex G-50柱中。在280 nm下測(cè)量洗出液的吸光值,所得到的色譜圖如圖3所示。

圖3 小紅豆抗菌蛋白的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography of the antifungal protein from small red beans on Sephadex G-50

由圖3可知,S3組分經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜后只得到1個(gè)主要的色譜峰G1,顯然經(jīng)過(guò)層層分離純化后,樣液中含有的蛋白種類(lèi)越來(lái)越少,更趨向于目標(biāo)蛋白。G1組分經(jīng)活性檢測(cè)被證明具有抑制真菌生長(zhǎng)的生物活性,收集目標(biāo)組分并重復(fù)制備,以備后續(xù)研究。

2.2 SDS-PAGE

將分離純化各個(gè)步驟得到的組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定其純度以及分子量大小，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,隨著分離純化的逐步進(jìn)行,各組分的電泳條帶數(shù)越來(lái)越少,清晰度越來(lái)越高。親和色譜是純化的第一道工序,得到的蛋白質(zhì)溶液是多種成分的混合體系,經(jīng)離子交換色譜后,與蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,可看到,S3組分中至少存在2種蛋白,一種蛋白質(zhì)的分子量約為97.2 kDa,另一種的分子量低于6.5 kDa。而凝膠過(guò)濾色譜后的G1組分只有1個(gè)清晰的條帶,說(shuō)明經(jīng)分離純化得到的抗菌蛋白已經(jīng)達(dá)到電泳純,以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)對(duì)它的相對(duì)遷移率(Rf)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),由此計(jì)算出G1組分分子量約為4 kDa。

圖4 小紅豆抗菌蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of the antifungal protein from small red beans注:1：小紅豆蛋白粗提液;2：硫酸銨沉降分離液; 3：親和藍(lán)膠色譜A2組分;4：離子交換色譜S3組分; 5：凝膠過(guò)濾色譜G1組分;M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量曲線Fig.5 Standard curves for protein molecular weight

2.3 蛋白含量的測(cè)定結(jié)果

以25 g小紅豆原材料為例,計(jì)算抗菌蛋白純化過(guò)程中的每一步所得樣品的蛋白含量,結(jié)果列于表1。由表1可知,25 g的小紅豆種子經(jīng)去皮后用緩沖液提取,約可得到粗蛋白溶液,隨著分離純化的逐步進(jìn)行,蛋白質(zhì)含量逐漸降低,一方面可能由操作造成損失,如緩沖液粗提時(shí)回收不完全、硫酸銨沉降離心后溶解不徹底等,另一方面蛋白質(zhì)逐漸純化,非目標(biāo)產(chǎn)物被逐步移除,這是蛋白質(zhì)含量減少的主要原因[21]。經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜后得到的目標(biāo)蛋白含量為4.27 mg。

表1 小紅豆抗真菌蛋白純化過(guò)程中蛋白含量Table 1 Concentration of purification of antifungal protein from small red beans

2.4 抗真菌活性

小紅豆抗真菌蛋白對(duì)來(lái)自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)均具有一定的抑制作用。采用瓊脂片擴(kuò)散法,若樣品對(duì)真菌具有抑制作用,則表現(xiàn)為濾紙片周?chē)木植烤z體生長(zhǎng)受到抑制,出現(xiàn)半圓形月牙狀的抑菌圈。小紅豆蛋白的抗真菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 小紅豆抗真菌蛋白抑菌活性Fig.6 Inhibitory activity of the antifungal protein from small red beans注：A:空白對(duì)照8 μL無(wú)菌水;B:40 μg/μL抗菌蛋白無(wú)菌水溶液;C:20 μg/μL抗菌蛋白無(wú)菌水溶液。

由圖6可以看出,在濾紙片B和C周?chē)汲霈F(xiàn)了較為明顯的抑菌圈,而A周?chē)婢木z正常生長(zhǎng),沒(méi)有出現(xiàn)半圓形抑菌圈。由此可見(jiàn),小紅豆純化的抗菌蛋白對(duì)以上三種不同來(lái)源的真菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性,且隨著抗菌蛋白濃度的提高,月牙形抑菌圈也越來(lái)越明顯。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)緩沖液初提、硫酸銨分級(jí)沉降、親和色譜、離子交換色譜及凝膠過(guò)濾色譜等步驟從小紅豆中分離純化出一種抗菌蛋白。對(duì)各分離純化步驟得到的蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定,對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)凝膠過(guò)濾色譜后得到抗菌蛋白達(dá)到電泳純,且相對(duì)分子質(zhì)量約為4 kDa。通過(guò)純化的小紅豆抗菌蛋白對(duì)茄子尖孢鐮刀菌、甜瓜尖孢鐮刀菌及苦瓜尖孢鐮刀菌的抗性實(shí)驗(yàn)證明小紅豆抗菌蛋白具有較強(qiáng)的抗真菌活性。

[1]朱立成,羅輝,曾鉑,等. 慈菇中抗真菌蛋白分離純化初步研究[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(4):33-36.

[2]呂慧,王夢(mèng)竹,孫素榮. 植物抗菌蛋白及其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,49(6):1073-1079.

[3]Carlini C R,Grossi-De-Sá M F. Plant toxic proteins with insecticidal properties:A review on their potentialities as bioinsecticides[J]. Toxicon Official Journal of the International Society on Toxinology,2002,40(11):1515-1519.

[4]鄭燦偉,賓金華. 植物抗真菌蛋白的抗菌機(jī)制[J]. 植物生理學(xué)通訊,2008,44(5):989-996.

[5]Touch V,Hayakawa S,Commins T. Natural antimicrobial proteins:a review of current challenges and solutions for food applications[J]. Asian Journal of Food and Agro-Industry,2009,2(1):1-16.

[6]韓俊華,陳大歡,黃繼翔. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化多粘類(lèi)芽孢桿菌HT16產(chǎn)生抗菌蛋白的培養(yǎng)基[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(13):262-265.

[7]Hosseini E S,Moniri R,Goli Y D,et al. Purification of Antibacterial CHAP K,Protein Using a self-cleaving fusion tag and its activity against methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. Probiotics and Antimicrobial Proteins,2016,8(4):1-9.

[8]李家磊,姚鑫淼,盧淑雯,等. 紅小豆保健價(jià)值研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂,2014,27(2):12-15.

[9]王春華. 紅小豆-多功能的補(bǔ)養(yǎng)品[J]. 東方食療與保健,2007,9(1):9-10.

[10]梁麗雅,閆師杰. 紅小豆的加工利用現(xiàn)狀[J]. 糧油加工與食品機(jī)械,2004,3(6):68-69.

[11]心平. 藥食兩用赤小豆[J]. 開(kāi)卷有益,2013,11(1):67.

[12]彭游,李仙芝,柏楊. 赤小豆活性成分的提取及保健功能研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(9):389-391.

[13]邵彪,汪少蕓,葉秀云,等. 黑豆中抗真菌蛋白的純化及活性鑒定[J]. 福州大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(6):945-948.

[14]李奕雅,汪少蕓,葉秀云,等. 花生抗真菌蛋白的純化及活性鑒定[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2006,6(1):243-246.

[15]Laemmli U K,Favre M. Gel electrophoresis of proteins [J]. J Mol Biol,1973(80):575-599.

[16]Lowry O H,Rosebrough N J,Farr A L,et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. J Biol Chem,1951,193(1):265-275.

[17]Ye XY,Ng TB. Mungin,a novel cyclophilin-like antifungal protein from the mung bean[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000,273(3):1111-1115.