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(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034)

羅非魚(Oreochromisniloticus)是一種十分廣泛的淡水養(yǎng)殖魚類。2015年產(chǎn)量為171萬噸[1]。目前,羅非魚的生產(chǎn)加工主要以出口冷凍魚肉片為主,加工過程產(chǎn)生的下腳料占全魚重的60%～70%,包括魚皮、魚頭、魚鰭和魚骨[2]。有效利用這些下腳料,避免浪費的同時還可減少環(huán)境污染[3]。且這些副產(chǎn)物中仍含豐富的蛋白質(zhì)[4],魚皮中含量最為豐富,而魚皮作為膠原蛋白和明膠的豐富來源[5]更為安全[6]。

明膠經(jīng)酶解制備成的明膠肽具有較高的生物活性,如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗菌活性等[7]。而且其富含多種氨基酸,不含脂肪,能夠滿足人們對“低脂高蛋白”這一類食品的需求。魚皮中的明膠肽,可增強低鈣水平下的骨膠原結(jié)構(gòu)、加強皮膚中膠原代謝的速度、改善與老化相關(guān)的膠原合成低下問題、預(yù)防及治療關(guān)節(jié)癥等膠原病[8]。酶法水解明膠后所得的生物活性肽中不含有機溶劑或有毒有害殘留物質(zhì)[9],故其與陸地動物皮膠原或明膠資源相比,已然成為制備天然抗氧化活性肽的最佳原料,近年來更是受到人們廣泛關(guān)注[10]。研究人員以多種魚皮作為原料,通過不同種類酶酶解制備多種明膠肽并對其抗氧化活性進(jìn)行的研究在逐漸增多。例如,Niranian等[11]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)魚皮明膠肽的N端為疏水性氨基酸,特別是纈氨酸或亮氨酸時,抗氧化活性較高。Zhang[12]發(fā)現(xiàn):組分中甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等含量較高的肽具有較好的抗氧化活性,預(yù)示明膠肽可以作為一種良好的抗氧化劑在食品中應(yīng)用。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolytic conditions of different protease

本研究以羅非魚皮為原料,提取明膠并以風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶作為工具酶制備具有抗氧化活性的羅非魚皮明膠肽,考察其ABTS自由基、DPPH自由基、羥基自由基清除活性及其對亞油酸過氧化體系的抑制作用。同時,以商品化的谷胱甘肽(GSH)為對照,評價羅非魚皮明膠肽的抗氧化活性。本研究為羅非魚皮蛋白質(zhì)資源高值化利用提供研究基礎(chǔ),同時也為制備新型食品抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚皮(tilapia skin) 廣西百洋水產(chǎn)集團(tuán)股份有限公司提供;風(fēng)味蛋白酶 酶活為34606 U/g,丹麥諾維信有限公司;胰蛋白酶 來源于豬胰臟,酶活為3000 U/g,南寧龐博生物制藥有限公司;胃蛋白酶 來源于豬胰臟,酶活為345160 U/g,上海生工生物工程股份有限公司;谷胱甘肽(GSH) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;trolox、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、亞油酸 美國Sigma-Aldrich公司;吐溫20、2-硫代巴比妥酸(TBA) 上海BBI生命科學(xué)有限公司;細(xì)胞色素C、甘氨酸、抑肽酶 上海生工生物股份有限公司;VB12美國Sigma-Aldrich公司;MOG(Myelin oligodendrocyte glycoprotein)、β-Amyloid 上海強耀生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

SHZ-D9循環(huán)水式真空泵、DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;Micro 17R微量臺式離心機 賽默飛世兒科技(中國)有限公司;PHS-3精密pH計 上海雷磁儀器公司;HITACHI CF16RXII 離心機 日本株式會社日立制作所;XW-80A漩渦振蕩器 上海精科實業(yè)有限公司;UV-5200型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;干浴器 德國IKA公司;Infinite200 NANO酶標(biāo)定量測定儀 TECAN(上海)貿(mào)易有限公司;A200電子自旋共振波譜儀 德國Bruker BioSpin公司;P230半制備高效液相色譜 大連依利特分析儀器有限公司;HH-6超聲波清洗機 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 明膠提取 羅非魚皮經(jīng)去鱗、切塊、清洗后,用0.1 mol/L NaOH溶液(1∶10,w/v)在4 ℃條件下攪拌24 h,每8 h換一次NaOH溶液,過濾,得沉淀,并洗至中性后,所得沉淀使用0.2 mol/L HAc溶液(1∶10,w/v)于4 ℃條件下攪拌24 h,每8 h換一次HAc溶液,過濾,所得沉淀用去離子水洗至中性,過濾,所得沉淀用去離子水(1∶10,w/v)在45 ℃條件下溶脹8 h。采用兩層濾布和Whatman NO.4濾紙過濾,濾液經(jīng)冷凍干燥后得魚皮明膠,于-30 ℃冷凍保存。

1.2.2 酶解物制備

1.2.2.1 酶解工藝 準(zhǔn)確稱取一定量的羅非魚皮明膠并補水至底物蛋白濃度為2%,在每種酶的最適溫度下保溫并調(diào)至適宜pH后加酶,于適宜溫度下恒溫酶解不同時間(保持pH恒定在最適),所得酶解液于100 ℃條件下滅酶10 min,將離心(4000 r/min,20 min)后所得上清液冷凍干燥,制得羅非魚皮明膠酶解物。

1.2.2.2 酶解條件 以風(fēng)味蛋白酶(34606 U/g)和胰蛋白酶(30000 U/g)為工具酶,以羅非魚皮明膠為底物,底物濃度以蛋白質(zhì)計,依據(jù)各種酶的商品說明書,分別在兩種酶的最適溫度和最適pH條件下進(jìn)行酶解,酶解具體條件如表1所示。

1.2.3 水解度的測定 水解度定義為水解過程中斷裂肽鍵數(shù)與底物中肽鍵總數(shù)的百分比,測定方法采用pH-stat法[13],以滴定所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積計算水解度。計算公式如下:

式中:DH-水解度,%;B-保持pH不變所消耗的堿(NaOH)的體積,mL;Nb-堿的當(dāng)量濃度,mol/L;Mp-底物中蛋白總量,g;htot-底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g,本研究中htot以7.5計;α-水解過程中α-氨基的解離度,計算公式如下:

式中:pH為酶解過程中恒定的pH;本研究中pK以7.5計。

1.2.4 三氯乙酸(TCA)可溶性肽得率的測定 按照金文剛等[14]的方法進(jìn)行測定,即三氯乙酸(TCA)沉淀結(jié)合Folin-酚的方法。取1 mL稀釋一定濃度的羅非魚皮明膠酶解液,加入1 mL的20%(w/v)的三氯乙酸(TCA)溶液,室溫條件下靜置20 min,13500 r/min離心10 min。吸取100 μL上清液,加入500 μL Folin-酚甲液,振蕩混勻后靜置10 min。再加入50 μL Folin-酚乙液,立即振蕩后靜置30 min。吸取200 μL該溶液加入96孔板中,3組平行,在500 nm波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值。根據(jù)繪制的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.6492x+0.0597,R2=0.9940)獲得水解液中TCA可溶性肽質(zhì)量。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)水解液中總蛋白質(zhì)量,計算TCA可溶性肽得率。

1.2.5 抗氧化能力的測定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力測定 參考Arts等[15]的方法進(jìn)行測定。具體方法如下,將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液1∶1混合,搖勻后室溫下避光孵育12～16 h制得ABTS+·溶液。測定前用0.2 mol/L PBS(pH7.4)緩沖溶液將ABTS+·溶液稀釋至OD734=0.7±0.02后,立即分別吸取1 mL加入到不同濃度羅非魚明膠水解物中于2 mL EP管中振蕩混合均勻,30 ℃干浴器內(nèi)避光反應(yīng)6 min,吸取200 μL反應(yīng)液加入到96孔板中,于734 nm波長下用酶標(biāo)儀測定吸光值,按照下式計算清除率。

ABTS自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100。

式中,A1為樣品吸光值;A0為以超純水代替樣品時所測吸光值。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0194x+0.0002,R2=0.9978),并將結(jié)果轉(zhuǎn)換成Trolox當(dāng)量。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力測定 參考金文剛等[16]的方法進(jìn)行測定。取0.2 mL不同濃度樣品溶液與0.4 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(0.04 g/L,pH6)、0.4 mL DPPH乙醇溶液(200 μmol/L)于1.5 mL離心管中混合均勻。振蕩后室溫下避光靜置30 min,4000 r/min離心10 min后,取200 μL該溶液加入96孔板中,于517 nm波長下用酶標(biāo)儀測定吸光值,按照下式計算清除率。DPPH自由基清除率(%)=[1-(As-A0)/A]×100。式中,As為樣品吸光值測定值;A0為以95%乙醇代替DPPH溶液時測定的吸光值;A為以去離子水代替樣品時的空白吸光值。

1.2.5.3 羥基自由基清除能力測定 參考段秀紅等[18]的方法即應(yīng)用電子自旋共振的方法(ESR)進(jìn)行測定,以Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH。取38 μL磷酸鹽緩沖溶液(PB)(pH7.4,0.15 mol/L),39 μL樣液,5 μL DMPO(1 mol/L),10 μL EDTANa2和FeSO4混合液(6 mmol/L),8 μL H2O2(6%),混合均勻,40 ℃避光孵育30 min后,立即吸入毛細(xì)管中,一端用凡士林封口后放入電子自旋共振波譜儀的諧振腔,進(jìn)行羥基自由基信號譜圖的測定。

利用磷酸鹽緩沖溶液(PB)配制不同濃度的樣品溶液,以GSH為對照,測定時以樣品溶液代替磷酸鹽緩沖溶液(PB)獲取羥基自由基信號譜圖。測試條件:中心磁場強度3368.99 G,微波功率0.721 mW,微波頻率9.44 GHz,放大倍數(shù)1.0×105,調(diào)制幅度1.00 G,調(diào)制頻率為100 kHz,時間常數(shù)81.92 ms,轉(zhuǎn)換時間40 ms。按照下式計算清除率,·OH的清除率E(%)=[(ho-hx)/ho]×100,其中ho和hx分別為體系中加入試樣前后ESR圖譜中第二個峰的峰高。

1.2.5.4 亞油酸過氧化抑制活性測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定亞油酸過氧化抑制活性[17]。將200 μL亞油酸與400 μL吐溫-20加入到19.4 mL磷酸緩沖溶液(PBS)(0.02 mol/L,pH7.4)中進(jìn)行乳化,超聲處理10 min后獲得混合均勻的亞油酸乳液。取500 μL亞油酸乳液,加入600 μL PBS(0.02 mol/L,pH7.4)、200 μL FeSO4(0.01%,w/v)、200 μL抗壞血酸(0.01%,w/v)及分別稀釋不同倍數(shù)的樣品500 μL,漩渦振蕩混勻后于37 ℃避光孵育24 h。向反應(yīng)24 h后的混合液中立即加入200 μL TCA(4%,w/v)、2 mL TBA(0.8%,w/v)、200 μL BHT(0.4%,w/v),于100 ℃沸水浴30 min,冷卻后的混合物于4000 r/min離心10 min,于534 nm處測定上清液吸光度,按照下式計算抑制率。亞油酸過氧化抑制率(%)=(A0-As)/A0×100。式中,As為樣品吸光值測定值;A0為以去離子水代替樣品時的空白測定值。

1.2.6 模擬胃腸道消化實驗 參考Sunantha Ketnawa等[19]人的方法稍作修改。模擬胃液消化方法如下,40 mg胃蛋白酶溶解于1 mL 0.1 mol/mL HCl中,制備模擬胃消化液。0.5 g羅非魚皮明膠酶解物凍干粉溶于35 mL超純水中,37 ℃下140 r/min振蕩孵育30 min。調(diào)節(jié)pH至2.0,加入125 μL模擬胃消化液(含5 mg胃蛋白酶,E∶S=1∶100 wt/wt),在37 ℃水浴條件下模擬胃液消化2 h;模擬腸液消化方法如下,20 mg胰蛋白酶和120 mg牛膽酸鈉溶解于10 mL 0.1 mol/mL NaHCO3中,制備模擬腸消化液。將上述模擬胃消化后的溶液pH調(diào)節(jié)至7.5,加入5 mL模擬腸消化液,在37 ℃水浴條件下繼續(xù)模擬腸液消化1 h,完成后于100 ℃水浴條件下加熱10 min進(jìn)行滅酶活,10000×g離心10 min取上清液,凍干成粉。

1.2.7 消化后羅非魚皮明膠酶解物分子量分布測定 參考金文剛等[20]人方法進(jìn)行測定。將經(jīng)胃腸道消化后酶解物用去離子水稀釋一定倍數(shù)后,0.45 μm微孔濾膜過濾后采用高效液相色譜,匹配Superdex Peptide 10/300GL(10 mm×300 mm)凝膠色譜柱進(jìn)行分子量分布測定,進(jìn)樣量10 μL;檢測波長:220 nm;流動相:體積比為超純水/乙腈/三氟乙酸(TFA)=70/30/0.1;洗脫流量:0.4 mL/min。分子量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用β-Amyloid、GSH、MOG、VB12、細(xì)胞色素C、抑肽酶及甘氨酸。對凝膠過濾色譜而言,分子質(zhì)量的對數(shù)(y)與保留時間(x)呈線性關(guān)系,經(jīng)計算所得分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-0.0713+5.6943(R2=0.9906)。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 每個樣品設(shè)三組平行,實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用http://www.physics.csbsju.edu/stats/t-test bulk form.html在線軟件進(jìn)行student’s t檢驗,p<0.05具有顯著性差異。半抑制率(IC50)的計算方法為:以樣品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),ABTS、DPPH、·OH自由基清除率或亞油酸過氧化抑制率(%)為縱坐標(biāo),獲取回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。通過回歸方程,計算DPPH自由基清除率或亞油酸過氧化抑制率為50%時樣品的濃度,即為IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅非魚皮明膠的水解曲線

利用風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶對羅非魚皮明膠進(jìn)行酶解,在加酶量為3000 U/g底物蛋白的條件下,酶解過程中水解度隨水解時間的變化曲線如圖1所示。隨著酶解時間的延長,風(fēng)味和胰蛋白酶的水解度在起始20 min內(nèi)上升較快,之后上升趨勢趨于平緩。相比而言,胰蛋白酶對羅非魚皮明膠的水解能力明顯強于風(fēng)味蛋白酶,且其水解度在中后期一直緩慢增加。在酶解60 min時，胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解的水解度分別為23.76%和4.41%。在酶解3 h后,胰蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解的水解度分別達(dá)到25.36%和5.8%,其原因可能是羅非魚皮明膠經(jīng)變性處理后,其蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)被破壞,而胰蛋白酶與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的酶切位點更容易發(fā)生作用,從而促進(jìn)了酶解。Wang等人[21]采用木瓜、中性、堿性和風(fēng)味蛋白酶分別對黃鰭金槍魚皮膠原進(jìn)行酶解,結(jié)果顯示不同的酶對蛋白質(zhì)的水解能力不同,其中風(fēng)味蛋白酶水解度最低,其水解黃鰭金槍魚皮膠原能力較弱,與本文結(jié)果相一致。

圖1 羅非魚皮明膠酶解過程中的水解度曲線Fig.1 DH curve of freeze-dried powder from tilapia skin gelatin in the process of hydrolysis

2.2 羅非魚皮明膠酶解物TCA可溶性肽含量及肽得率

從圖2中可以看出,兩種酶的酶解物肽含量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。酶解時間為0～30 min時,風(fēng)味蛋白酶與胰蛋白酶的酶解物TCA可溶性肽含量基本相當(dāng),酶解到60 min時,胰蛋白酶酶解物TCA可溶性肽含量稍高于風(fēng)味蛋白酶酶解物TCA可溶性肽含量,兩種酶的酶解物中肽含量均達(dá)最高,分別為56.82%和54.44%。酶解120 min開始,風(fēng)味蛋白酶酶解物肽含量反超胰蛋白酶酶解物肽含量,且兩種酶的酶解物肽含量均逐漸下降。綜合工業(yè)化生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效率及樣品水解度,選擇風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶酶解60 min所得的2個樣品進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 羅非魚皮明膠酶解物TCA可溶性肽得率Fig.2 TCA soluble oligopeptide content of tilapia skin gelatin hydrolyastes

2.3 羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化能力評價

以風(fēng)味蛋白酶60 min酶解物(F-60)及胰蛋白酶60 min酶解物(T-60)為原料,以GSH為陽性對照,利用ABTS自由基、DPPH自由基、·OH清除活性及亞油酸過氧化反應(yīng)體系,通過比較半抑制率(IC50),評價F-60及T-60的抗氧化能力。由圖3～圖6可見,羅非魚皮明膠酶解物及GSH均具有一定的清除ABTS自由基、DPPH自由基、·OH和抑制亞油酸過氧化的能力,且樣品的抗氧化能力均隨著濃度的升高而逐漸增強,呈明顯的劑量依賴性。

圖3 不同樣品對ABTS自由基的清除能力Fig.3 ABTS radical scavening capacities of different samples

圖4 不同樣品對DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavening capacities of different samples

圖5 不同樣品對·OH的清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavening capacities of different samples

圖6 不同樣品對亞油酸過氧化能力Fig.6 Linoleic acid anti-peroxidation capacities of different samples

如表2所示,根據(jù)擬合的回歸方程,計算各樣品的半抑制率(IC50),結(jié)果顯示,四種抗氧化指標(biāo)中,風(fēng)味蛋白酶-羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化能力大小依次為亞油酸過氧化抑制能力>·OH清除能力>DPPH自由基清除能力>ABTS自由基清除能力;而胰蛋白酶-羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化能力大小依次為·OH清除能力>DPPH自由基清除能力>亞油酸過氧化抑制能力>ABTS自由基清除能力。相較于胰蛋白酶-羅非魚皮明膠酶解物,風(fēng)味蛋白酶-羅非魚皮明膠酶解物具有較高的DPPH自由基清除活性及亞油酸過氧化抑制能力,但兩種酶解物的抗氧化活性均弱于GSH。

表2 羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化能力評價Table 2 Evaluation of antioxidant capacities of tilapia skin gelatin hydrolysates

圖7 經(jīng)模擬胃腸道消化前后的不同樣品對ABTS自由基、DPPH自由基、·OH的清除及亞油酸過氧化抑制能力Fig.7 ABTS,DPPH,·OH radical scavening and linoleic acid peroxidating capacities of different samples before and after gastrointestinal digestion in vitro注:不同小寫字母代表消化與未消化樣品間差異顯著(p<0.05)。

相同酶解時間條件下,兩種蛋白酶酶解物表現(xiàn)出了不同程度的抗氧化活性,說明蛋白酶的種類不同對多肽的品質(zhì)有重要影響,而這與Hou等[22]研究結(jié)果一致。風(fēng)味蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除活性及亞油酸過氧化抑制活性均高于胰蛋白酶酶解物,這與圖1羅非魚皮明膠水解度結(jié)果并不一致,顯示具有較高水解度的胰蛋白酶酶解物并不具有較強的抗氧化活性,說明酶解物的抗氧化活性與水解度并不一致。這一結(jié)果與Zhou等[23]以鮑魚內(nèi)臟蛋白酶酶解液體外抗氧化活性研究結(jié)果一致,其研究結(jié)果表明鮑魚內(nèi)臟蛋白酶酶解液的水解度、氨基酸組成和抗氧化活性均與采用的蛋白酶有關(guān),而酶解物的抗氧化活性與水解度無正相關(guān)性。對于陽性對照GSH,其DPPH自由基清除能力最強,IC50值達(dá)0.067±0.004 mg/mL,這一結(jié)果與Wang等[24]對魚皮低聚肽氨基酸組成及抗氧化活性研究中還原性谷胱甘肽的DPPH清除活性高于·OH自由基清除活性一致,且與其DPPH清除活性IC50值0.030 mg/mL結(jié)果相近。羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化活性均低于GSH,其原因可能是酶解物本身是包含多肽及其他化合物等不均一的混合物,故體系內(nèi)仍會存在一定量的大分子量物質(zhì)。

2.4 羅非魚皮明膠酶解物模擬體外胃腸道消化前后的抗氧化能力評價

將F-60及T-60樣品模擬體外胃腸道消化后的樣品凍干,以ABTS自由基、DPPH自由基、·OH清除和亞油酸過氧化反應(yīng)體系為評價指標(biāo),以同濃度下未經(jīng)胃腸道消化樣品作為陽性對照,評價經(jīng)模擬的胃腸道消化后羅非魚皮明膠酶解物的抗氧化能力。

由圖7A、圖7C可以看出,風(fēng)味蛋白酶60 min酶解物經(jīng)胃腸道消化后其ABTS自由基清除活性及亞油酸過氧化抑制能力顯著降低(p<0.05),均下降約50%;消化前后其DPPH自由基清除活性幾乎不變(圖7B);而·OH清除活性顯著增強(p<0.05),提高約1.3倍(圖7D)。胰蛋白酶60 min酶解物經(jīng)胃腸道消化后ABTS自由基清除活性基本不變(圖7A);DPPH自由基及·OH清除活性顯著增強(p<0.05),分別增加約1倍和0.47倍(圖7B、圖7E);而圖7C顯示,亞油酸過氧化抑制能力顯著降低(p<0.05)約75%。

以上結(jié)果表明,風(fēng)味蛋白酶及胰蛋白酶60 min酶解物經(jīng)模擬胃腸道消化后,亞油酸過氧化抑制能力均顯著降低,而·OH自由清除活性均顯著提升。消化前后兩種酶的酶解物自由基清除活性不一致,抗氧化活性顯著降低階段可能為模擬胃液消化階段,相關(guān)研究[25]結(jié)果表明,由于胃蛋白酶對許多高活性肽段的酶切降解,故在經(jīng)胃消化后使物質(zhì)發(fā)生改變,從而阻礙其與自由基反應(yīng),促使抗氧化肽的原有活性顯著降低;而模擬腸消化階段,胃酶酶解物經(jīng)胰蛋白酶消化后會進(jìn)一步生成小肽和氨基酸,或者處于該階段的酶解物暴露的活性基團(tuán)較多,酶解物與自由基反應(yīng)的機會增加,抗氧化活性也會相應(yīng)增加,而由于酶解采用的酶不同,其抗氧化活性回升程度大小不同,故會導(dǎo)致不同種類酶酶解樣品消化前后自由基清除活性變化大小有所差異。綜上所述,羅非魚皮明膠酶解物經(jīng)過胃腸道消化后,具有一定的抗氧化活性。

2.5 羅非魚皮明膠酶解物經(jīng)模擬體外胃腸道消化前后的分子量分布范圍

對羅非魚皮明膠酶解物模擬胃腸道消化前后樣品的分子量分布范圍進(jìn)行考察,結(jié)果如表3。根據(jù)保留時間并結(jié)合峰面積,對照標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量和保留時間,發(fā)現(xiàn)未經(jīng)模擬胃腸道消化的酶解物分子量主要分布在≥3000 Da范圍內(nèi),是一種分子量較大的混合物;而其經(jīng)過胃腸道消化后,兩種酶解產(chǎn)物各段分子量范圍內(nèi)變化均較為顯著(p<0.05)(胰蛋白酶酶解物1000～3000 Da范圍除外),風(fēng)味及胰蛋白酶酶解物經(jīng)體外模擬胃腸道消化后分子量主要集中于3000～5000 Da左右,此組分的含量與消化前相比分別提高了45%及13%;風(fēng)味蛋白酶酶解物對照消化前其1000～3000 Da組分含量提高了1.62倍;兩種酶解物大于5000 Da的組分含量經(jīng)消化后有一定程度的減少,分別減少約51%和6%,仍屬于一種復(fù)雜的混合物體系。以上結(jié)果表明,風(fēng)味及胰蛋白酶酶解物經(jīng)體外模擬胃腸道消化后其抗氧化活性的變化可能分別與體系中3000～5000 Da組分含量上升有關(guān)。

表3 羅非魚皮明膠酶解物的分子量分布Table 3 The molecular mass distribution of hydrolysates of tilapia skin gelatin

Qin等[26]通過對菜籽餅粕蛋白模擬胃腸道消化過程抗氧化活性進(jìn)行研究結(jié)果顯示,消化后產(chǎn)物分子量范圍在211～5000 Da的多肽含量占總多肽含量的85%,此時體系中多肽具較高的抗氧化活性。Sunantha Ketnawa等[19]對3種堿性蛋白酶酶解所得鯰魚皮明膠酶解物模擬胃腸道消化后產(chǎn)物抗氧化活性進(jìn)行了研究,研究結(jié)果顯示,模擬胃腸道消化后的明膠水解產(chǎn)物抗氧化活性顯著提高,其酶解物消化后主要分子量在366～1602 Da范圍。而且已有相關(guān)研究[27]報道指出蛋白水解物的抗氧化活性不僅依賴于多肽分子量的大小,還與肽的序列及所用酶的特異性有關(guān)。

3 結(jié)論

羅非魚皮明膠經(jīng)風(fēng)味蛋白酶及胰蛋白酶酶解60 min時,其水解度及TCA可溶性肽含量最高,分別達(dá)到4.41%、56.82%和23.76%、54.44%。以ABTS自由基、DPPH自由基、·OH清除能力及亞油酸過氧化抑制能力為評價指標(biāo),確定酶解60 min時風(fēng)味蛋白酶酶解物的清除DPPH自由基及抑制亞油酸過氧化能力較胰蛋白酶酶解物強,但弱于商品化的GSH。風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶酶解60 min的羅非魚皮明膠酶解物經(jīng)體外模擬胃腸道消化后其分子量分布范圍仍主要集中于3000～5000 Da,大于10000 Da組分含量顯著降低,小于3000 Da組分含量有所提高,酶解物整體抗氧化活性有一定提高。以上研究結(jié)果說明,風(fēng)味及胰蛋白酶酶解60 min后所得羅非魚皮明膠酶解物具有一定的抗氧化能力,具有潛在的開發(fā)價值。

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