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(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

芒果是五大熱帶水果之一,素有“熱帶果王”之稱[1]。芒果營(yíng)養(yǎng)豐富,含有維生素A、B1、B2、C、蛋白質(zhì)和葉酸等物質(zhì)[2]。芒果還具有止咳化痰,抗炎鎮(zhèn)痛,抗病毒,抗腫瘤的作用[3]。芒果屬于躍變型水果,采后需要后熟過程,會(huì)變軟變黃。而隨著芒果的后熟,一些病害也隨之產(chǎn)生,最常見的是炭疽病和蒂腐病[4]。這兩種采后病害在芒果八成熟時(shí)開始發(fā)病,并快速蔓延到整個(gè)果實(shí),如果不采取防治措施,損失率將達(dá)到40%以上。炭疽病主要由膠孢炭疽菌引起,感染后,芒果表皮出現(xiàn)圓形或多邊形褐色斑點(diǎn)[5]。蒂腐病主要由可可球二孢菌引起,在田間侵染芒果果實(shí),在運(yùn)輸過程中發(fā)病,造成果實(shí)腐爛[6]。

膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.)是導(dǎo)致絕大多數(shù)的水果和蔬菜的采后病害的致病菌[7]?？刂七@種病害通常使用傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑,如多菌靈·硫磺、甲基托布津、炭疽靈福鋅等等。然而化學(xué)殺菌劑的濫用,造成環(huán)境的嚴(yán)重污染,對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅[8]?？茖W(xué)家開始尋找可以替代的無害生物殺菌劑[9]。研究發(fā)現(xiàn)放線菌、真菌、細(xì)菌能夠降低果蔬采后病害的發(fā)生[10]。由于絕大數(shù)酵母菌不會(huì)產(chǎn)生毒素,故成為最佳的生物拮抗劑,受到前所未有的關(guān)注[11]。美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrim)已經(jīng)被報(bào)道可以有效降低蘋果、葡萄、葡萄柚、櫻桃番茄等水果采后病害的發(fā)生[12-13]。拮抗機(jī)理的研究有助于更好地發(fā)現(xiàn)有效的拮抗菌和使用增效劑提高拮抗菌的效果。其中最重要的拮抗機(jī)理有營(yíng)養(yǎng)空間競(jìng)爭(zhēng)、抗生素的產(chǎn)生、直接寄生、酶的分泌[14-15]。膠孢炭疽菌的細(xì)胞壁主要有幾丁質(zhì)和葡聚糖組成,幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶可以降解病原菌細(xì)胞壁,起到殺死病原菌的作用[16]。生物膜是自養(yǎng)型與異養(yǎng)型微生物形成陰離子,分泌固定在細(xì)胞表面保護(hù)微生物[17]。鐵元素對(duì)于真菌的生長(zhǎng)和病害的發(fā)生十分重要,非致病菌的鐵螯合作用可以作為一種新型的拮抗機(jī)理[18]。本實(shí)驗(yàn)研究了美極梅奇酵母對(duì)芒果炭疽病的抑菌效果,從胞外酶的分泌、生物膜的形成、鐵螯合作用方面,對(duì)抑菌機(jī)理做了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.) 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，28 ℃在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d,4 ℃保存，用接種環(huán)刮取菌絲,置于10 mL無菌蒸餾水中,用紗布過濾,獲得孢子懸浮液,血球計(jì)數(shù)器將其濃度調(diào)節(jié)至1×105spores/mL;美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima) 是前期實(shí)驗(yàn)室從芒果園中分離得到,發(fā)酵液在4 ℃下12000×g離心20 min,棄上清液后用蒸餾水重懸,得到酵母菌懸液,血球計(jì)數(shù)器調(diào)節(jié)濃度至1×108cells/mL;芒果果實(shí) (臺(tái)農(nóng))采摘于海南省昌江縣芒果園內(nèi),采摘生理成熟期,沒有機(jī)械或微生物損傷的芒果果實(shí),1.5%次氯酸鈉表面消毒2 min,自來水洗滌,在室溫(28 ℃)下干燥,置于塑料容器中;酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD) 酵母浸提物10 g,細(xì)菌學(xué)蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,1000 mL的蒸餾水；酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPDA) 瓊脂20 g,酵母浸提物10 g,細(xì)菌學(xué)蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,1000 mL的蒸餾水；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,1000 mL的蒸餾水。

ZEAL-WAYGR60DA高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;FYL-YS-280L型恒溫箱 北京福意電器有限公司;Shimadzu spectrophotometer UV-1800 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司;TG16KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;NRY-211恒溫培養(yǎng)搖床 上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;HITACHIS-3000N掃描電子顯微鏡 蘇州瑞測(cè)精密儀器有限公司;HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀 蘇州瑞測(cè)精密儀器有限公司;BioTek Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 YPD中酵母菌對(duì)芒果炭疽抑菌效果測(cè)定 將200 mL YPD培養(yǎng)基分裝在500 mL的三角瓶中,121 ℃滅菌15 min,接種1 mL酵母菌懸液和1 mL炭疽菌孢子懸浮液。以只接種1 mL炭疽菌孢子懸浮液的培養(yǎng)基作為對(duì)照。每隔24 h用8層紗布過濾,并用無菌水沖洗3次,測(cè)菌絲濕重;將菌絲放在紗布(放菌絲前稱重)上置于80 ℃的恒溫干燥箱中48 h,測(cè)其干重。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每個(gè)處理3個(gè)平行。

1.2.2 芒果果實(shí)上酵母菌對(duì)病原菌抑菌效果測(cè)定 用打孔器(8 mm)在每個(gè)芒果腰部刺兩個(gè)1 mm深的傷口。每個(gè)處理50個(gè)果實(shí),共4個(gè)處理:A:在傷口處接種50 μL的無菌水,作對(duì)照;B:接種25 μL炭疽孢子懸浮液和25 μL無菌水;C:接種25 μL酵母菌懸液和25 μL無菌水;D:在傷口處接種25 μL酵母菌懸液,1 h后接種25 μL炭疽孢子懸浮液。

處理后的芒果果實(shí)放在塑料容器中,每個(gè)處理設(shè)置兩組,分別放在溫度為25 ℃和15 ℃,相對(duì)濕度為90%以上的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。觀察和測(cè)量病斑直徑,根據(jù)Benbow和Sugar[19]的方法確定對(duì)疾病抑制率。計(jì)算拮抗酵母對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑菌率的公式如下:

抑菌率(%)=(LDc-LDr)/LDc×100

式(1)

式(1)中:LDc-病斑直徑(處理組B);LDr-病斑直徑(處理組C、D)。

1.2.3 驗(yàn)證胞外裂解酶的存在 美極梅奇酵母分泌幾丁質(zhì)酶的能力參照Rojas-Avelizapa[20]等人的方法,葡聚糖酶的能力參照Lutz[21]等人的方法。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定 在YPD培養(yǎng)基中分別加入20 g/L病原菌細(xì)胞壁(CWP)、20 g/L葡萄糖、5 g/L膠體幾丁質(zhì)、20 g/L CWP+5 g/L膠體幾丁質(zhì)、20 g/L CWP+20 g/L葡萄糖,滅菌,每個(gè)處理分別加入美極梅奇酵母懸浮液1 mL。在25 ℃,180 r/min培養(yǎng),分別在0、24、48、72、96、120 h下取樣,4 ℃,9600 r/min離心10 min,收集上清液。幾丁質(zhì)酶活性用Duraisamy等人[22]的方法測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定 將CWP、葡萄糖、昆布多糖、CWP+昆布多糖、CWP+葡萄糖等作為碳源加入到Y(jié)PD培養(yǎng)基中,按1.2.4方法取樣。β-1,3-葡聚糖酶活性用Somogyi[23]的方法測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 拮抗酵母生物膜的檢測(cè) 參照Parafati等[24]的方法研究拮抗酵母形成生物膜的能力。預(yù)處理好的芒果用酵母菌懸液浸泡后,參照潘洵操等[25]的方法,在掃描電鏡下,觀察酵母菌在芒果果皮上形成生物膜,以接種無菌水的芒果皮為對(duì)照。

1.2.7 鐵對(duì)色素生成和拮抗作用的影響 參照Saravanakumar等[26]的方法。YPDA培養(yǎng)基中FeCl3的濃度為5、10、15、20 μg/mL,酵母菌培養(yǎng)4 d。觀察和測(cè)量拮抗酵母形成的色素帶的大小及抑菌圈的大小。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin(8.5版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),使用SPSS Statistics 17進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1拮抗酵母對(duì)芒果炭疽的抑菌效果

2.1.1 YPD培養(yǎng)基中抑菌效果 從圖1可以看出,在接種了酵母菌的培養(yǎng)基中,炭疽菌絲的濕重和干重都明顯的低于對(duì)照組。對(duì)照組中,菌絲的濕重和干重在第2 d后急劇上升;在接種酵母的培養(yǎng)基中炭疽菌絲濕重和干重在第3 d時(shí),達(dá)到最大值,分別是1.1673 g和0.0082 g,第5 d時(shí),對(duì)照組菌絲濕重是處理組的38.89倍,對(duì)照組菌絲干重是處理組的88.85倍。在第3 d以后,培養(yǎng)基中的環(huán)境較前期發(fā)生變化,已經(jīng)不適合炭疽生長(zhǎng),加上培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,拮抗酵母通過分解炭疽菌絲獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),所以第3 d后,炭疽菌絲干重、濕重開始下降。由此可見,拮抗酵母菌可以明顯的抑制芒果炭疽菌絲的生長(zhǎng)。

圖1 美極梅奇酵母對(duì)炭疽菌絲濕重和干重的影響Fig.1 The effect of Metschnikowia pulcherrima on wet weight and dry weight of anthrax hyphae

2.1.2 芒果果實(shí)上的抑制效果 圖2顯示了不同處理后芒果果實(shí)上的病斑直徑。15 ℃,接種12 d時(shí),對(duì)照組A、處理組B、處理組C和處理組D的病斑直徑大小分別是8.0,18.94,8.0和11.2 mm,其中處理組A、C與處理組B、D間差異顯著(p<0.05)。與處理組B相比,處理組C和處理組D的病斑直徑明顯降低10.94和7.74 mm,其抑菌率達(dá)到了57.81%和40.87%。當(dāng)芒果果實(shí)被貯藏在25 ℃下時(shí),其病斑直徑和抑菌率與15 ℃有著相同的趨勢(shì),這就表明美極梅奇酵母明顯的降低了芒果傷口處由膠孢炭疽造成的傷害(所有處理測(cè)得的病斑直徑都包括打孔直徑8 mm)。

圖2 芒果傷口病斑直徑的變化Fig.2 The changes of lesion diameters in mango wound注:A-無菌水;B-膠孢炭疽;C-美極梅奇酵母;D-美極梅奇酵母和膠孢炭疽。

2.2拮抗酵母對(duì)芒果炭疽的抑菌機(jī)理

2.2.1 胞外裂解酶的產(chǎn)生 由圖3可以看出美極梅奇酵母菌落周圍均出現(xiàn)淡黃色透明圈,表明美極梅奇酵母可以水解膠體幾丁質(zhì)(幾丁質(zhì)酶活性)和昆布多糖(β-1,3-葡聚糖酶),美極梅奇酵母菌擁有產(chǎn)生分泌這兩種胞外裂解酶的能力。

圖3 美極梅奇酵母產(chǎn)生裂解酶的能力Fig.3 The ability of the yeast Meyerozyma pulcherrima to produce lyase

2.2.2 幾丁質(zhì)酶的活性 由圖4可以看出,美極梅奇酵母菌在五種碳源的誘導(dǎo)下,均能分泌產(chǎn)生一定量的胞外幾丁質(zhì)酶,不同的碳源對(duì)酵母菌的誘導(dǎo)能力有所不同,酶活達(dá)到最大值的時(shí)間也不同,但整體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。CWP+膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶活性最高,達(dá)到最大值的時(shí)間也最短,其OD值第2 d達(dá)到了0.3867 nm/min/mL;葡萄糖誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶活性最低,第4 d時(shí)達(dá)到最大值,OD值為0.2333 nm/min/mL。CWP+膠體幾丁質(zhì)的OD值是葡萄糖得1.7倍。實(shí)驗(yàn)表明,CWP、膠體幾丁質(zhì)能夠誘導(dǎo)美極梅奇酵母菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

圖4 不同處理對(duì)胞外裂解酶-幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on the activity of extracellular lyase-chitinase注:A-葡萄糖;B-CWP;C-膠體幾丁質(zhì);D-CWP+膠體幾丁質(zhì);E-CWP+葡萄糖。

2.2.3β-1,3-葡聚糖酶的活性 由圖5可以看出,美極梅奇酵母菌在加CWP、葡糖糖、昆布多糖的培養(yǎng)基中均有β-1,3-葡聚糖酶的產(chǎn)生,隨著接種時(shí)間的增加,其活性也逐漸上升。其中添加CWP+葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中,β-1,3-葡聚糖酶的活性明顯地高于其他四中處理的,在第6 d時(shí),其OD值高達(dá)0.3177 nm/min/mL。添加了葡萄糖和昆布多糖的培養(yǎng)基中,β-1,3-葡聚糖酶的活性都明顯較低,兩種處理也沒明顯差異,第6 d時(shí)OD值分別為0.1772、0.1827 nm/min/mL。說明,美極梅奇酵母菌在CWP、葡萄糖的誘導(dǎo)下能夠分泌更多的β-1,3-葡聚糖酶。

圖5 不同處理對(duì)胞外裂解酶-β-1,3-葡聚糖酶活性的影響Fig.5 Effects of different treatments on the activity of extracellular lyase-β-1,3-glucanase注:A-葡萄糖;B-CWP;C-昆布多糖;D-CWP+葡萄糖;E-CWP+昆布多糖。

2.2.4 生物膜 培養(yǎng)3 h后,經(jīng)過反復(fù)沖洗,美極梅奇酵母仍能夠附著在壁上(OD 1.478±0.12)。對(duì)照組的OD值為0.008。經(jīng)過24 h后,OD值并未明顯降低(OD 1.218±0.1)。72 h后OD值下降至0.481,酵母菌形成的生物膜隨著時(shí)間會(huì)逐步降解。圖6中B、C為不同倍數(shù)掃描電鏡下美極梅奇酵母在芒果果皮上形成的生物膜。

表1 鐵對(duì)色素生成和拮抗作用的影響Table 1 Effects of iron on pigment formation and antagonism

注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖6 經(jīng)處理后芒果果皮的掃苗電鏡觀察Fig.6 Observation of mango peel after treatment by SEM注:A-用無菌水處理芒果,作為對(duì)照;B-用美極梅奇酵母處理芒果,放大倍數(shù)1800×;C-用美極梅奇酵母處理芒果,放大倍數(shù)4700×。

2.2.5 產(chǎn)生色素的能力及拮抗效果的影響 由表1可以發(fā)現(xiàn),在不同濃度的FeCl3培養(yǎng)基中,美極梅奇酵母菌周圍的色素帶由淺粉色變成深紅色。隨著FeCl3濃度的增加,顏色逐漸加深。在不加FeCl3或者FeCl3濃度為5 μg/mL時(shí),色素帶寬度分別為5.3、4.2 mm,明顯高于濃度為10、15、20 μg/mL時(shí)。當(dāng)不加FeCl3時(shí),抑菌圈為6.4 mm,當(dāng)FeCl3的濃度為20 μg/mL時(shí),抑菌圈為2.1 mm,前者是后者的3倍。實(shí)驗(yàn)表明,美極梅奇酵母菌產(chǎn)生色素的能力越低,對(duì)膠孢炭疽菌的拮抗效果越好。

3 討論與結(jié)論

芒果炭疽病是造成芒果腐爛,影響芒果品質(zhì)的主要采后病害之一。該研究發(fā)現(xiàn),美極梅奇酵母對(duì)芒果炭疽病有較明顯的抑制作用,能抑制膠孢炭疽菌的生長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)在研究美極梅奇酵母的抑菌效果的基礎(chǔ)上,對(duì)其抑菌機(jī)理做了初步研究。發(fā)現(xiàn)CWP、葡萄糖、膠體幾丁質(zhì)能夠誘導(dǎo)美極梅奇酵母菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶,這兩種裂解酶可以分解病原菌細(xì)胞壁,近而殺死病原菌,降低芒果炭疽病的發(fā)病率。美極梅奇酵母具有形成生物膜的能力,能夠在芒果表面形成保護(hù)膜,防止病原菌的入侵。在含有Fe3+的培養(yǎng)基中,美極梅奇酵母能夠產(chǎn)生紅色色素帶,表明酵母可以吸收周圍環(huán)境中的Fe3+。當(dāng)濃度增加時(shí),美極梅奇酵母產(chǎn)生的色素帶反而變窄,說明酵母菌只是微量吸收Fe3+,濃度過高反而會(huì)抑制酵母菌的活性。在培養(yǎng)基中,Fe3+濃度增加時(shí),抑菌圈變窄,說明美極梅奇酵母在低鐵環(huán)境中拮抗效果更好。

許多研究也表明,拮抗菌可以有效的降低芒果炭疽病的發(fā)生。李春玲等人[27]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)芒果炭疽病菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到了99.86%,抑菌效果顯著;高云慨等人[28]發(fā)現(xiàn)季也蒙畢赤酵母在活體接種實(shí)驗(yàn)中對(duì)芒果炭疽菌有顯著的的生防效果,在接種第4 d時(shí),抑菌率達(dá)到了80%。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的拮抗菌-美極梅奇酵母更加豐富了芒炭疽病的生防酵母菌庫(kù),為有效抑制炭疽病的發(fā)生做出貢獻(xiàn)。雖然研究發(fā)現(xiàn)很多酵母菌可以減少采后病害的發(fā)生,但是目前商業(yè)化的酵母菌很少,主要原因是拮抗酵母菌的抑菌機(jī)理尚不清楚,對(duì)其生產(chǎn)應(yīng)用造成了阻力。在膠孢炭疽菌細(xì)胞壁中,幾丁質(zhì)作為結(jié)構(gòu)主鏈排列有序,而β-1,3-葡聚糖作為填充材料以無定型的方式排列。膠孢炭疽菌細(xì)胞壁的分解需要不同酶的參與,特別是β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶,還有蛋白酶。因此,幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶可以直接或間接參與拮抗酵母抑制病原菌的拮抗機(jī)理中。Saravanakumar等人[29]發(fā)現(xiàn)Trichodermaasperellum能夠分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、β-1,3-葡聚糖酶等,并篩選出Trichodermaasperellum最優(yōu)培養(yǎng)溫度和pH。拮抗菌若能夠成功地在受傷的水果表面定殖、繁殖,就必須具備相應(yīng)的附著、定殖能力。在大多數(shù)情況下,這種能力與生物膜的形成相關(guān)。Parafati等人[25]發(fā)現(xiàn)Wickerhamomycesanomalus能過在葡萄表面形成生物膜,對(duì)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)有一定的拮抗作用。Bautista-Rosales等人[30]在掃描電鏡下觀察到Meyerozyma caribbica在芒果表面形成了生物膜。Fe3+對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和發(fā)病十分重要,Fe3+的競(jìng)爭(zhēng)在采后病害的生物防治中扮演重要角色。拮抗酵母菌對(duì)氧氣和Fe3+要求較低,通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)Fe3+可以抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)以及孢子的萌發(fā)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Sipiczki等人[31]的有相似之處,美極梅奇酵母和病原菌之間存在著鐵元素的競(jìng)爭(zhēng)。

綜上所述,美極梅奇酵母對(duì)芒果炭疽菌有一定抑制作用,其抑菌效果是多種拮抗機(jī)理相互作用的結(jié)果,包括分泌保外裂解酶,形成生物膜,鐵螯合等,該實(shí)驗(yàn)是一個(gè)初步探討,對(duì)拮抗機(jī)理仍需要更深入的研究。

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