程曉宏，楊 俊，周 楠，史玉坤

（1．南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南通226006； 2．南通市疾病預(yù)防控制中心，南通226007）

蘇丹紅，又名“蘇丹”，是人工合成的偶氮類、油性化工染料，被廣泛應(yīng)用于油、蠟的增色及鞋、地板等的增光方面。由于蘇丹紅染色后的食品顏色鮮艷且不褪色，能刺激消費(fèi)者的購(gòu)買欲和食欲，一些不法商家非法添加蘇丹紅染料于辣椒醬、火鍋底料等辣椒制品中。毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性［1］。蘇丹紅Ⅰ號(hào)在人類肝細(xì)胞研究中顯現(xiàn)可能的致癌特性，在我國(guó)禁止其作為色素添加劑在食品中使用。因此，建立測(cè)定蘇丹紅的方法具有重要意義。

目前測(cè)定蘇丹紅的方法主要有液相色譜法［2－4］和液相色譜－質(zhì)譜法［5－6］。國(guó)家質(zhì)檢總局曾發(fā)布食品中蘇丹紅染料測(cè)定方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［7］。這些方法在樣品經(jīng)正己烷提取、中性氧化鋁柱層析凈化后，用反相高效液相色譜－紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器或質(zhì)譜進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法定量。但該方法使用有機(jī)溶劑多，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且氧化鋁的活性不易控制，回收率難以得到保證。本工作采用分子印跡的原理吸附蘇丹紅（分子印跡固相萃取小柱能選擇性地識(shí)別和富集蘇丹紅染料，正己烷淋洗樣品中油性雜質(zhì)，二氯甲烷洗脫蘇丹紅染料），使用有機(jī)溶劑少，耗時(shí)短，去油效果佳，克服了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的缺點(diǎn)，建立了同時(shí)測(cè)定辣醬中4種蘇丹紅的分子印跡固相萃取小柱－高效液相色譜分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀，配四元泵、在線真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器；AS20500BDT型超聲波清洗器；MTN－2800D型氮吹儀；XW－80A型渦旋混合器；Millipore純水儀；0．22μm親水聚四氟乙烯（PTFE）針式濾膜；蘇丹紅專用分子印跡固相萃取小柱。

蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1．0g·L－1，稱取蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品各0．100 0g，經(jīng)乙醚溶解后用正己烷定容于100mL容量瓶中。

乙腈為色譜純，乙醚、正己烷、丙酮、二氯甲烷、冰乙酸為分析純，試驗(yàn)用水為二級(jí)純水。

1．2 色譜條件

ZORBAX SB－C18色譜柱（4．6mm×150mm，5μm）；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為35 ℃；流量為1．0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為500nm。流動(dòng)相：A為0．1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～4min時(shí)，A為20%；4～14min時(shí)，A由20%線性降至0，保持6min；20～22min時(shí)，A由0線性升至20%，保持3min。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品制備

稱取混合均勻的樣品0．50g于10mL比色管中，加入正己烷－丙酮（3＋1）混合液5mL稀釋，用超聲波水浴提取10min，漩渦混勻，快速定性濾紙過(guò)濾，反復(fù)提取兩次后合并提取液，得樣品上清液，再經(jīng)45℃氮吹至近干后，用正己烷5mL溶解殘?jiān)?，備用?/p>

1．3．2 分子印跡固相萃取小柱活化與平衡

將蘇丹紅專用分子印跡固相萃取小柱放置在固相萃取裝置上，使用前先采用二氯甲烷5mL活化，再用正己烷5mL平衡固相萃取小柱。

將上述備用液全部上樣（上樣前確保固相萃取小柱的濕潤(rùn)），用正己烷5mL進(jìn)行淋洗，用二氯甲烷5mL進(jìn)行洗脫。將收集的洗脫液在45℃下氮吹至近干，用乙腈1mL定容，過(guò)0．22μm 親水PTFE針式濾膜，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig．1 Chromatogram of sudan mixed standard solution

2．2 試驗(yàn)條件的選擇

蘇丹紅染料屬于油性染料，能較好地溶解于正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑中。乙酸乙酯、乙腈、甲醇可較好地從樣品中提取出蘇丹紅，但是它們的沸點(diǎn)較高，考慮到提取液需要氮吹，它們不適合作為提取試劑。因此，選擇正己烷和丙酮作為樣品提取試劑。由于辣醬樣品中含水量較大，試驗(yàn)選用正己烷－丙酮（3＋1）混合液作為提取試劑。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件，選擇氮吹儀輔助45℃濃縮提取液。

蘇丹紅Ⅰ的最大吸收在480nm左右，蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ的最大吸收在500nm左右、蘇丹紅Ⅳ的最大吸收在520nm附近，綜合兼顧4種蘇丹紅染料，試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為500nm。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法［7］中使用不同比例的甲酸、乙腈、丙酮混合液作為流動(dòng)相，操作繁瑣，且分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)40min。由于甲酸易燃燒、易還原，且凝固點(diǎn)較低，試驗(yàn)選擇乙酸替代。為簡(jiǎn)化流動(dòng)相配制過(guò)程，試驗(yàn)選擇流動(dòng)相A為0．1%乙酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈。

試驗(yàn)提高乙腈初始比例和梯度變化速率，還對(duì)梯度程序的初始沖洗時(shí)間、最后沖洗時(shí)間進(jìn)行了合理縮減，選擇的梯度洗脫程序見(jiàn)1．2節(jié)。

試驗(yàn)選擇流量為1．0mL·min－1，進(jìn)樣量為20μL。35℃比室溫（25℃）更穩(wěn)定，為了獲得較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，試驗(yàn)選擇柱溫為35℃。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用乙腈將1．0g·L－1蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按儀器工作條件對(duì)上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0．1～5．0mg·kg－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab．1 Linear regression equations and correlation coefficients

以3倍信噪比計(jì)算蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的檢出限（3S／N）均為10μg·kg－1。

2．4 精密度與回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白辣醬樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于6．0%，日間RSD小于8．0%，該方法具有較好的精密度。

2．5 樣品分析

試驗(yàn)選取某超市的20份辣醬樣品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均為未檢出。某陰性樣品及其加標(biāo)（0．2mg·L－1）的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 樣品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of the sample

由圖2可知：陰性樣品雜質(zhì)峰大幅減少，分子印跡固相萃取小柱能較好地凈化基質(zhì)雜質(zhì)和富集蘇丹紅染料。

本工作采用分子印跡固相萃取小柱－高效液相色譜法測(cè)定辣醬中4種蘇丹紅。分子印跡固相萃取小柱重復(fù)性好，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，能滿足辣醬中蘇丹紅的定性分析和定量分析要求。

［1］ 師邱毅，紀(jì)其雄，許莉勇．食品安全快速檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010．

［2］ 李盛安，馮敏鈴，李擁軍．超高效液相色譜法測(cè)定番茄醬中4種蘇丹紅染料殘留效果研究［J］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（9）：279－280．

［3］ 邸萬(wàn)山．高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定辣椒制品中蘇丹紅［J］．中國(guó)食品添加劑，2016（3）：171－174．

［4］ 史俊文，劉鳳芝，張?jiān)剑z滲透色譜凈化－高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的蘇丹紅染料［J］．理化檢驗(yàn)－化學(xué)分冊(cè)，2015，51（1）：57－60．

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［7］ GB／T 19681－2005 食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法高效液相色譜法［S］．