羅燕文，田平，華燦楓，陶詩煜，倪迎冬

(南京農業(yè)大學農業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

隨著人民生活水平的改善，人們對乳制品的需求不斷提高。為了滿足奶牛高產奶的能量需求，通常在飼料里添加大量易發(fā)酵的精飼料，這雖然在一定程度上提高了反芻動物的生產性能，但過量攝入會導致瘤胃代謝異常，最終引發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis, SARA)[1]。該病是集約化奶牛場中的一種多發(fā)性代謝疾病，常伴隨瘤胃上皮損傷、腹瀉、乳房炎、蹄葉炎等臨床疾病[2]，嚴重影響奶牛健康和泌乳性能，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[3]。

肝臟是調節(jié)糖代謝，維持機體能量平衡的主要組織。肝臟是糖異生的主要場所[4], 而糖異生是反芻動物最重要的糖原合成途徑。在反芻動物，90%葡萄糖都是由肝糖異生產生[5]。反芻動物體內的碳水化合物不能被直接利用，只能在瘤胃內經(jīng)微生物發(fā)酵后生成揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)，其中丙酸作為主要生糖前體物進入肝臟后生成丙酮酸，經(jīng)丙酮酸羧化酶(pyruvic carboxylase, PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)催化后最終異生成糖[6]。此外，肝臟也是脂肪代謝的重要器官，其脂質代謝作用對乳脂的合成至關重要。肝臟對來自脂肪組織分解產生的游離脂肪酸、瘤胃發(fā)酵產生的揮發(fā)性脂肪酸、日糧來源的長鏈脂肪酸等代謝產物進行轉化和分配[7]，最終決定乳脂的數(shù)量與質量[8]。

目前多集中于研究高精料對反芻動物乳腺組織脂肪代謝的影響，而對肝臟糖代謝和脂代謝的研究較少。本研究以泌乳中期奶山羊為實驗動物，初步探索長期和短期飼喂高精料日糧對其肝臟糖脂代謝的影響及相關機制。本研究為緩解泌乳奶山羊能量負平衡和實現(xiàn)定向調控乳脂的合成提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TRIzol Reagent 購自上海英俊生物技術有限公司；SYBR Premix Ex TaqTM 購自TaKaRa公司；肝糖原、總膽固醇、甘油三酯試劑盒均購自南京建成生物研究所。冷凍離心機(Allegra TM64R,BECKMAN COULTERTM,美國);電動勻漿器；Mx3000P Real-time PCR儀(STRATAGENE,美國)；酶標儀(Synergy2，Bio Tek，美國)；NanoDrop TM1000(Thermo Scientific，美國); Ysmex-2100全自動血液分析儀(希森美康生物科技有限公司)。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)

本實驗于2013年5月開始，選取16只健康狀況良好的二胎次泌乳中期關中奶山羊(購自陜西西安)，飼養(yǎng)于西北農林科技大學實驗用動物房。隨機分為3組，低精料組(精粗比35∶65，LC，n=5)、短期高精料組(精粗比65∶35，HS，n=4),飼喂期為4周，長期高精料組(精粗比65∶35，HL，n=7)，飼喂期為19周。日糧營養(yǎng)成分含量同參考文獻[9]。實驗結束后宰殺采集血液和肝臟組織樣。整個實驗期間，動物自由飲水，每日擠奶時間為早晨8:00和下午6:00。

1.3 樣品采集

1.3.1血液的采集 實驗結束后，用采血針、肝素鈉真空離心管經(jīng)頸靜脈采血，4 ℃，3000 r·min-1離心15 min，收集血漿，-20 ℃保存。

1.3.2肝臟的采集 采集肝臟組織，立即放入液氮，-80 ℃保存。

1.4 甘油三脂和總膽固醇的測定

用Ysmex-2100全自動血液分析儀(希森美康生物科技有限公司)檢測血漿中葡萄糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCH)等指標。

按南京建成生物工程研究所生產的試劑盒說明書測定肝糖原(蒽酮法)[10]、肝臟甘油三酯和總膽固醇等指標。

1.5 樣品處理與分析測定

1.5.1樣品總RNA提取和cDNA的制備 稱取50 mg左右的肝臟組織，用Trizol一步法提取總RNA， NanoDrop分光光度計檢測RNA濃度和純度，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質量，-70 ℃保存?zhèn)溆?。反轉錄酶體系及Tap酶為 Promega 產品。引物采用Primer 6.0軟件設計目的基因引物序列，由南京金唯智生物工程有限公司合成，引物見表1。PCR的反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。實時熒光定量分析采用2-ΔΔCT法[11]，以GAPDH為內標基因，計算目的基因轉錄的相對量，通過以下公式計算出每一個樣本的ΔΔCT值，最后每一個樣本值以2-ΔΔCT表示，x表示任意一個樣本，公式如下：ΔΔCT=(CT.目的基因-CT.內參基因)x-(CT.目的基因-CT.內參基因)control。

1.5.2組織總蛋白提取 蛋白酶抑制劑混合片(Roche，4693132001)購于上海羅氏制藥有限公司；BCA蛋白測定試劑盒(Thermo，23225)購于南京生興生物技術有限公司，硝酸纖維素膜(PALL，T91375)購于巴傲得生物科技有限公司；Pierce發(fā)光檢測試劑盒(Thermo，NC15080或34076)購于南京生興生物技術有限公司。

稱取50 mg左右的肝臟組織，加入10倍體積冰浴的RIPA(radio immuno precipitation assay buffer)總蛋白裂解液；充分勻漿后冰上靜置10 min，4 ℃，12000 r·min-1離心20 min，取上清。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白統(tǒng)一用蛋白裂解液稀釋至合適的濃度，變性，-80 ℃冰箱儲存。上樣量10 g，分離膠10%，濃縮膠4%，電泳，轉印至硝酸纖維素膜上，之后室溫封閉2 h，接著一抗4 ℃搖床孵育過夜，1×TBST洗膜10 min 3次，再用二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗膜10 min 3次，最后，采用凝膠成像系統(tǒng)Versa DocTM Imaging System進行發(fā)光檢測，并用Quantity One Software軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 20.0軟件進行單變量雙因素分析；用ANOVA進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同精料比日糧對血糖和肝糖原的影響

如圖1所示，HS組和HL組山羊的血糖和肝糖原濃度顯著高于LC組(P<0.05)。

2.2 不同精料比日糧對血液肝臟中膽固醇、甘油三酯的影響

由表2可知，與LC組相比，HS和HL組奶山羊血漿甘油三酯水平顯著降低(P<0.05)，膽固醇水平無顯著變化(P>0.05)。HS組肝臟中膽固醇和甘油三酯含量顯著增高(P<0.05)，而HL組膽固醇和甘油三酯含量沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

2.3 不同精粗比日糧對肝臟糖代謝相關基因和蛋白表達的影響

如圖2所示，與LC組相比，HS組奶山羊肝臟組織中PC基因水平和PCK2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；HL組奶山羊PC和GLUT2基因表達水平顯著升高(P<0.05), 但3個糖異生關鍵酶的蛋白表達水平均無顯著變化(P>0.05)。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of the target gene

續(xù)表1 Continued Table 1

F:上游引物 Forward primer; R:下游引物 Reverse primer. GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PC:丙酮酸羧化酶Pyruvic carboxylase；PCK1:胞漿型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 Cytosolic phosphoenolpyruvate carboxylase; PCK2:線粒體型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 Mitochondrional phosphoenolpyruvate carboxykinsae; G6Pase:葡萄糖-6-磷酸酶 Glucose-6-phosphatase; HK:己糖激酶 Hexokinase; GLUT2:葡萄糖轉運蛋白2 Glucose transporter 2; GLUT4:葡萄糖轉運蛋白4 Glucose transporter 4; LXRβ: 肝X受體β Liver X receptor β; ACC:乙酰輔酶A羧化酶Acetyl CoA carboxylase; CD36:分化抗原簇36 Cluster of differentiation 36；SCD:硬脂酰輔酶A去飽和酶 Stearoyl-CoA desaturase；DGAT:二酰基甘油?；D移酶Diacylgycerol acyltransferase; FAS:脂肪酸合酶Fatty acid synthase; FADS1:脂肪酸去飽和酶1 Fatty acid desaturases 1; FADS2:脂肪酸去飽和酶2 Fatty acid desaturases 2; ACSL1:長鏈脂酰CoA合成酶 Long-chain acyl-CoA synthetase; ACSS1:脂酰輔酶A合成酶1 Acyl-CoA synthetase1; ACSS2:脂酰輔酶A合成酶2 Acyl-CoA synthetase 2; LPL:脂蛋白脂肪酶Lipoprotein lipase; CPT1:肉堿棕櫚酰轉移酶-1 Carnitine palmitoyltransferase-1; HADH:3-羥脂酰輔酶A脫氫酶3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase； SREBP1:固醇調節(jié)元件結合蛋白1 Sterol regulatory element-binding protein 1; PPARα:過氧化物酶增殖物激活受體-α Peroxisome proliferator-activated receptor alpha; PPARγ:過氧化物酶增殖物激活受體-γ Peroxisome proliferator-activated receptor gamma; LXRα:肝X受體α Liver X receptor α; LDLR:低密度脂蛋白受體Low density lipoprotein receptor; HMGCR: 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase; LDLR:低密度脂蛋白Low density lipoprotein receptor; CYP7α1:膽固醇7α-羥化酶Cholesterol 7α-hydroxylase; CYP27A1:膽固醇27α羥化酶 Sterol 27-hydroxylase; FXR:法尼酯X受體Farnesoid X receptor; SREBP2:固醇調節(jié)元件結合蛋白2 Sterol regulatory element binding protein 2.

2.4 不同精粗比日糧對肝臟脂代謝相關基因的影響

如圖3所示，與LC組相比，HS組奶山羊肝臟中SCD、DGAT和SREBP1基因表達水平顯著升高(P<0.05)，其他脂合成相關基因的表達無顯著變化(P>0.05)。而HL組脂代謝相關基因的表達均無顯著變化(P>0.05)。

圖1 不同精粗比日糧對血糖(A)和肝糖原(B)的影響Fig.1 The effect of different concentrate ratio diet on the level of plasma glucose (A) and hepatic glycogen(B) LC:低精料組 Low concentrate; HS:短期高精料組 High concentrate for short term; HL:長期高精料組 High concentrate for long term. 不同字母代表差異顯著(P<0.05)Values with different letters mean significant difference (P<0.05).

部位Part指標ParametersLCHSHL血Blood膽固醇CHOL(mmol·L-1)2.22±0.082.31±0.332.35±0.16甘油三酯TG(mmol·L-10.25±0.03a0.16±0.02b0.17±0.01b肝臟Liver膽固醇CHOL(μmol·g-1)0.57±0.03b1.00±0.20a0.69±0.07ab甘油三酯TG(mmol·L-1)0.12±0.02b0.26±0.04a0.20±0.05ab

LC:低精料組 Low concentrate; HS:短期高精料組 High concentrate for short term; HL:長期高精料組 High concentrate for long term. 同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)In the same row, the different letters mean significant difference atP<0.05.

圖2 不同精粗比日糧對肝臟糖代謝相關基因(A)和蛋白(B)表達的影響Fig.2 Effect of different concentrate ratio diet on mRNA (A) and protein (B) expression of glucose metabolic genes in liver 不同字母代表差異顯著(P<0.05)，#表示組間有差異趨勢 (0.05

2.5 不同精粗比日糧對肝臟膽固醇代謝相關基因的影響

如圖4所示，與LC組相比，HS組奶山羊肝臟膽固醇合成的關鍵酶HMGCR mRNA表達水平顯著升高，SREBP2基因表達水平呈現(xiàn)升高趨勢(P=0.76)，而與膽固醇分解相關的基因CYP7α1顯著降低(P<0.05)；HL組膽固醇代謝相關基因的表達均無顯著變化(P>0.05)。

圖3 不同精粗比日糧對肝臟脂代謝相關基因表達的影響Fig.3 Effect of different concentrate diet on genes expression involved in lipid metabolism

圖4 不同精粗比日糧對肝臟膽固醇代謝相關基因表達的影響Fig.4 Effect of different concentrate diet on genes expression involved in cholesterol metabolism

3 討論

3.1 不同精粗比對血糖及肝糖原的影響

血糖濃度的變化反映了機體糖代謝的動態(tài)平衡狀態(tài)，血糖的水平亦體現(xiàn)了機體的能量代謝水平[12]。肝糖原是葡萄糖的儲存形式之一，對維持血糖穩(wěn)定非常重要。張樹坤[13]用高精料日糧飼喂泌乳期奶山羊兩周后，血糖濃度顯著上升。周傳朋[14]用碳水化合物日糧飼喂淡水魚，其肝糖原含量隨日糧碳水化合物水平的增加而升高。本實驗結果顯示，短期或長期飼喂高精料日糧均能使血糖和肝糖原水平顯著增高，與以往研究報道結果相一致。

體內甘油三酯和膽固醇水平是反映脂代謝狀態(tài)最常見的指標[15]。郭勇慶等[16]用含有20%細粉碎小麥的全混合日糧誘導奶牛發(fā)生SARA后，肝臟甘油三酯合成作用增強，含量顯著增加，血液甘油三酯顯著降低。本研究也發(fā)現(xiàn)，短期高精料組肝臟甘油三酯增加，血液甘油三酯降低。但是，Van等[17]的研究結果表明，長期高精料組肝臟甘油三酯無顯著變化，但血液甘油三酯顯著降低，這可能與較低的瘤胃pH減弱了脂解作用和瘤胃中不飽和脂肪酸的氫化作用有關。

3.2 不同精粗比日糧對肝臟糖代謝相關基因和蛋白表達的影響

肝臟是機體糖異生的重要位點。反芻動物所需的葡萄糖90%來自于肝臟糖異生作用。丙酮酸羧化酶(PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)是糖異生途徑的關鍵酶[6]，這些酶的mRNA表達水平直接決定著糖異生的速度[18-19]。PEPCK存在兩個亞型，一個是位于細胞質的PCK1，另一個是位于線粒體的PCK2[20]，PCK1 主要參與以氨基酸為底物的糖異生，而PCK2負責以乳酸為底物的糖異生[21]；此外，提高PC的表達可增加內源性葡萄糖的產生。在本試驗中，短期飼喂高精料日糧后肝臟中PCK2的蛋白水平顯著提高，提示以乳酸為底物的糖異生加強；長期或短期飼喂高精料日糧后，丙酮酸羧化酶基因表達水平顯著升高，提示肝臟糖異生作用增強。此外，葡萄糖轉運蛋白2(GLUT2)主要存在于肝臟、腎臟和胰島β細胞[22]。肝細胞中的葡萄糖載體蛋白97%都是GLUT2[23]，主要負責肝臟上皮細胞基膜側的葡萄糖轉運，促進肝臟對葡萄糖的攝取和利用。GLUT2表達升高促進葡萄糖轉運，為肝糖原合成增加提供條件。本實驗結果顯示，長期飼喂高精料日糧奶山羊肝臟GLUT2 mRNA水平顯著升高，這可能是肝糖原含量升高的原因之一。

3.3 不同精粗比日糧對肝臟脂代謝的影響

肝臟是脂肪合成與代謝的主要器官之一。硬脂酰 CoA 去飽和酶(SCD)是調節(jié)肝臟脂肪合成的關鍵酶之一，有SCD1和SCD2兩種亞型，其中SCD1是表達于肝臟的主要亞型[24]，催化肝細胞中飽和脂肪酸脫氫形成棕櫚油酸CoA和油酸CoA，這兩種產物是甘油三酯合成的底物。Miyazaki等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠攝入高碳水化合物食物后顯著提高其肝臟內SCD1蛋白的表達和活性。Listenberger等[26]的研究表明，小鼠肝細胞過表達SCD1，可增強甘油三脂的合成作用，調節(jié)脂肪酸的再合成。二酰甘油酰基轉移酶(diacylgycerol acyltransferase，DGAT) 是甘油三酯合成中唯一的核心限速酶，其作用是催化二酰甘油加上脂肪酸酰基形成三酰甘油[27]。此外，固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)是一種重要的核轉錄因子，主要參與脂肪生成基因的調節(jié)[28]。本試驗結果得出，HS組山羊肝臟中SCD、DGAT 和SREBP-1 mRNA表達水平顯著增高，從而促進甘油三酯的合成，但長期飼喂高精料對奶山羊肝臟甘油三酯的合成沒有明顯影響。

脂肪酸β氧化能影響肝臟內脂肪酸的含量。肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1(carnitinepalmitoyl transterase-1, CPT-1)是參與脂肪酸分解代謝的關鍵基因[29],負責調控長鏈脂肪酸進入線粒體進行β氧化。短期飼喂高精料組奶山羊CPT1轉錄水平下調，而長期組無變化，提示短期組山羊肝臟脂肪酸氧化減弱。

肝臟中TG水平由TG合成、分解及脂蛋白分泌等過程決定，反芻動物肝臟內的甘油三酯主要以極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)的形式運輸出肝臟。短期高精料組肝臟甘油三酯的合成作用增強，脂肪酸氧化減弱，脂肪合成大于分解，因此肝輸出的VLDL濃度降低，血液中甘油三酯濃度下降。而長期飼喂高精料對脂肪合成與分解無顯著影響，這可能是因為短期飼喂高精料日糧能增加血液皮質醇濃度，皮質醇具有促進肝臟脂合成的作用，而長期飼喂高精料日糧可導致慢性應激[30]，降低皮質醇濃度[31]，從而削弱了皮質醇促進脂合成的作用，最終導致長期高精料日糧組肝臟中TG水平?jīng)]有顯著變化。但血液中的甘油三酯卻顯著下降，這可能是因為較低的瘤胃pH減弱了脂解作用和瘤胃中不飽和脂肪酸的氫化作用[17]。

3.4 不同精粗比日糧對肝臟膽固醇代謝的影響

體內膽固醇的平衡是由膽固醇的合成、吸收和異化協(xié)調控制[32]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)是膽固醇合成的關鍵酶[33]，其表達和活性直接影響膽固醇合成。固醇調節(jié)元件結合蛋白2(SREBP2)是膽固醇合成通路的主要調控元件[34]，SREBP2過表達會加重肝細胞膽固醇積累[35]。膽固醇7a-羥化酶(CYP7α1)是肝臟膽汁酸合成途徑中的關鍵限速酶，催化肝臟中膽固醇轉化成膽汁酸排出體外[36]。Jones等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，缺乏CYP7α1的小鼠其肝臟內膽固醇升高。本研究結果表明，短期高精料組奶山羊肝臟內HMGCR基因表達顯著上調，SREBP2有升高的趨勢，CYP7α1表達顯著下降，說明肝臟膽固醇合成增加，分解減弱，造成肝臟膽固醇也顯著增加。而長期高精料日糧則無此效應，這可能是因為應激會激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，使腎上腺皮質激素增加，進而引起體內膽固醇水平升高[38]，而長期飼喂高精料日糧導致的應激可使下丘腦-垂體-腎上腺軸活性逐漸降低[31]，最終導致長期高精料日糧組膽固醇水平?jīng)]有顯著變化。

4 小結

短期飼喂高精料日糧可上調肝臟中糖異生相關基因和蛋白的表達，增強肝臟糖異生能力，并能改變肝臟脂代謝和膽固醇代謝相關基因的表達，促進甘油三酯和膽固醇的合成；長期飼喂高精料日糧也可通過上調肝臟中糖異生相關基因的表達，增強肝臟糖異生能力，但對肝臟脂代謝沒有顯著影響。

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