李銀蘋， 張學銘， 汪開誠， 應 磊， 汪 洋， 王萬鐵， 金可可

(溫州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 浙江 溫州 325035)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見而嚴重的慢性并發(fā)癥，研究表明，高血糖導致的腎臟細胞凋亡參與糖尿病腎病的發(fā)生和進展。糖尿病腎病的基本病理改變?yōu)榧毎饣|增生，基膜增厚，晚期出現彌漫性腎小球硬化，最終導致腎衰竭。腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell)是重要的靶細胞及效應細胞，易發(fā)生高血糖誘導的細胞凋亡和損傷，在糖尿病腎病的發(fā)展中起重要作用[1-4]。近年的研究表明，氧化應激(oxidative stress)反應是糖尿病腎病的重要發(fā)病機制之一[5-6]，可引發(fā)腎小球系膜細胞凋亡[7]，使用抗氧化劑可有效改善糖尿病動物的腎臟損傷，防止腎臟纖維化[8-9]。

自2007年，Ohsawa等[10]在《Nature Medicine》報道氫在機體內具有選擇性抗氧化治療作用以來，國內外研究者已陸續(xù)發(fā)現氫在缺血-再灌注損傷、動脈粥樣硬化和代謝綜合征等多種疾病過程中發(fā)揮抗氧化作用[11-13]，證實氫分子能特異性中和自由基中毒性最強的·OH和ONOO-而產生明顯的抗氧化反應，同時氫分子亦可增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等抗氧化酶的活性[14]，并抑制氧化應激引起的細胞凋亡[15]。但目前氫分子對糖尿病腎病的干預作用尚未見報道，本研究通過體外細胞培養(yǎng)實驗，觀察氫分子對高糖狀態(tài)下腎小球系膜細胞凋亡相關蛋白表達以及核因子E2 相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)信號通路的影響，并探討可能的機制，以期為糖尿病腎病的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES13購自中國科學院細胞庫。細胞培養(yǎng)用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)低糖[5.5 mmol/L葡萄糖(glucose)]DMEM培養(yǎng)基，5% CO2條件下培養(yǎng)，實驗分為4組：正常對照(normal control,C)組用低糖(5.5 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；甘露醇(mannitol,G)組用低糖加甘露醇(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)DMEM培養(yǎng)基；高糖(high glucose,H)組用高糖(25 mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基；高糖+富氫水(high glucose+hydrogen-rich water,HH)組用富氫水配制高糖干粉DMEM(25 mmol/L葡萄糖干粉DMEM+富氫水)培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中，高糖+富氫水組每6 h換液1次且培養(yǎng)基現配現用，其余3組每24 h換液 1 次，8～14代細胞用于本實驗。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、FBS和高糖干粉DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco；富氫水購自北京活力氫源飲品有限公司(氫氣濃度大于0.8 mmol/L，氫氣與水穩(wěn)定結合，開罐4 h氫氣濃度仍大于0.4 mmol/L)；二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)、RIPA裂解液、SOD活性檢測試劑盒和BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天；兔抗鼠Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)和NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO-1]單克隆抗體均購自Abcam；兔抗鼠Bax、Bcl-2和caspase-3單克隆抗體均購自 Cell Signaling Technology；HRP標記山羊抗兔IgG購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo。所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

3 主要方法

3.1Western blot 法 造模48 h后，各組加入500 μL裂解液(含5 μL PMSF)， 冰上裂解細胞20 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品，行SDS-PAGE，濕式電轉移法轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉90 min，TBST漂洗3次后，分別加 I 抗[Nrf2(1∶1 000)、caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)和NQO-1(1∶10 000)]，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加 II 抗室溫孵育 1 h，再次 TBST 洗滌，滴加ECL發(fā)光液暗室曝光后，采用Quantity One圖像分析系統(tǒng)對各條帶灰度值進行分析，以目的蛋白條帶吸光度與內參照β-actin條帶吸光度的比值反映目的蛋白的表達水平。

3.2RT-PCR法測定mRNA的表達 采用RT-PCR法檢測各組細胞HO-1和NQO-1 mRNA的表達，Trizol法提取總RNA并測定RNA濃度，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，引物序列如表1。PCR反應條件： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 50 ℃(HO-1和β-actin)/ 52 ℃(NQO-1)30 s， 72 ℃ 1 min， 32個循環(huán)； 72 ℃ 5 min。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的基因條帶灰度值與內參照β-actin基因條帶灰度值的比值反映目的基因的表達水平。

表1 RT-PCR引物序列

3.3SOD活性的檢測 收集各組細胞，冰浴勻漿，4℃離心，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3.4超氧化物陰離子熒光探針檢測活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 用含5 μmol/L DHE的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃孵育細胞30 min， 進行熒光探針裝載，PBS洗滌2次，熒光顯微鏡進行檢測，采用ImageJ 軟件進行半定量分析。

4 統(tǒng)計學處理

使用 SPSS 20.0 軟件分析，計量資料行正態(tài)性檢驗，實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，多組樣本的均數比較先行方差齊性檢驗，方差齊者兩兩比較行 SNK-q檢驗，方差不齊者行 Dunnett’s 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與C組比較，H組中Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平上調，Bcl-2蛋白表達下調(P<0.05)，而HH組上述蛋白與C組比較差異均無統(tǒng)計學顯著性；與H組比較，HH組的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平明顯下調，Bcl-2表達明顯上調(P<0.05)，見圖1。這提示高糖狀態(tài)下，氫分子可提高抗凋亡蛋白和降低促凋亡蛋白的水平。

Figure 1. The effects of hydrogen molecule on the protein levels of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖1氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2 氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞ROS及SOD活性的影響

與C組比較，H組的紅色熒光明顯增強，提示H組細胞內的ROS水平較C組增高；與H組比較，HH組的紅色熒光明顯減弱，提示HH組細胞內的ROS水平較H組明顯降低，見圖2。這表明氫分子可有效降低高糖誘導的ROS水平。

Figure 2. The effects of hydrogen molecule on ROS production in glomerular mesangial cells cultured with high glucose (DHE method, ×200). Mean±SD.n=4.*P<0.05vsC group;△P<0.05vsH group.

圖2氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞活性氧表達的影響

H組的SOD活性較C組明顯降低(P<0.05)，而HH組的SOD活性與C組比較，差異無統(tǒng)計學顯著性，且HH組的SOD活性明顯高于H組(P<0.05)，見圖3，提示氫分子可有效提高高糖狀態(tài)下抗氧化酶的活性。

3 氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞Nrf2信號通路的影響

與C組比較，H組Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達降低，HO-1和NQO-1的mRNA表達也降低(P<

Figure 3. The effects of hydrogen molecule on the activity of SOD in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖3氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞SOD活性的影響

0.05)；HH組的Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達及HO-1和NQO-1的mRNA表達均明顯高于H組(P<0.05)，見圖4、5。

討 論

DN是糖尿病常見而嚴重的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。目前認為， 細胞凋亡在 DN 的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[16]。 研究發(fā)現，腎小球系膜細胞凋亡參與DN的發(fā)病[17]。本實驗表明，高糖可明顯誘導腎小球系膜細胞促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，抑制其抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。

氧化應激是細胞凋亡的重要誘因，高血糖可誘導產生大量的活性氧，并超過機體的清除能力，使氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，引起脂質、蛋白質、DNA 過氧化及線粒體損傷，誘導細胞凋亡。Sugiyama等[7]在電子顯微鏡下也觀察到ROS可明顯誘導人腎小球系膜細胞凋亡，提示采取措施抑制高糖引發(fā)的氧化應激反應可能是改善DN的重要策略。我們發(fā)現，高糖狀態(tài)下，腎小球系膜細胞產生大量的活性氧并伴有SOD活性的降低，且促凋亡相關蛋白表達相應增加，抗凋亡蛋白表達相應減少。采用富氫水干預后，可明顯降低其活性氧水平，并顯著提高抗氧化酶SOD活性，同時伴有抗凋亡蛋白表達增加和促凋亡蛋白表達減少，提示氫分子通過其選擇性的抗氧化作用，對高糖狀態(tài)下的腎小球系膜細胞發(fā)揮抗凋亡的保護作用。

Nrf2信號通路是目前發(fā)現的最重要的內源性抗氧化應激通路，在糖尿病氧化損傷中起關鍵的抑制作用[18]。Nrf2 廣泛存在于心、肺、肝、腎和神經系統(tǒng)等組織器官內，是內源性抗氧化應激通路Nrf2-ARE通路中重要的轉錄因子，其通過與抗氧化反應元件ARE相互作用調節(jié)編碼抗氧化蛋白。生理狀態(tài)下，Nrf2在細胞漿中與它的抑制蛋白Keap1結合，保持低活性狀態(tài)；當細胞暴露于氧化應激或親電子混合物時，Nrf2從Keap1上游離出來，轉位入細胞核中，與ARE結合，從而促使下游的HO-1和NQO1等的表達，發(fā)揮抗氧化的作用[2]。研究報道，Nrf2激活劑可減輕糖尿病所致腎臟的氧化損傷和炎癥反應[18-19]，而Nrf2-KO糖尿病小鼠較對照鼠表現為更大量的腎臟ROS產物和嚴重的DNA氧化損傷[20]；Nrf2及其下游蛋白NQO1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)的激活能夠顯著改善STZ誘導的野生型糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷。本研究結果顯示，高糖(25 mmol/L葡萄糖)組Nrf2蛋白以及HO-1和NQO-1 mRNA及蛋白表達降低，與Bai等[21]在糖尿病心肌病的研究結果一致，但Li等[22]在高糖組用30 mmol/L葡萄糖造模卻得到了相反的實驗結果，推測原因可能與糖濃度不同有關。高糖組ROS水平明顯升高，提示高糖組處于高氧化應激狀態(tài)，而高糖狀態(tài)加富氫水干預后，可以顯著提高Nrf2蛋白以及下游HO-1和NQO-1的mRNA及蛋白表達，且ROS水平相應降低，提示氫分子對高糖誘導的腎小球系膜細胞氧化應激反應具有抑制作用。因此，本研究初步認為，氫分子作為一種新型的 Nrf2 激活劑，可能通過上調Nrf2表達，激活下游抗氧化蛋白表達，增強細胞抗氧化能力，從而在高糖狀態(tài)下對腎小球系膜細胞發(fā)揮抗凋亡作用。

Figure 4. The effects of hydrogen molecule on the protein levels of Nrf2， HO-1 and NQO-1 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖4氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達的影響

Figure 5. The effects of hydrogen molecule on the mRNA expression of HO-1 and NQO-1 in glomerular mesangial cells cultured with high glucose. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC group;#P<0.05vsG group;△P<0.05vsH group.

圖5氫分子對高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞HO-1和NQO-1mRNA表達的影響

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