趙曉霖， 彭雯雯， 劉國英， 洪 玲， 李明余， 潘燕霞

(福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院康復(fù)治療學(xué)系， 福建 福州 350004)

高血壓前期(prehypertension)是指血壓處于120～139/80～90 mmHg的特定階段，又稱正常高值血壓。目前我國高血壓前期患病率為33.6%[1]。高血壓前期發(fā)展成高血壓和發(fā)生心血管病的風(fēng)險是正常血壓的2倍[2]。因此，應(yīng)當(dāng)在高血壓前期進行積極干預(yù)，減少高血壓和心血管病的患病率。從高血壓前期進展到高血壓的機制十分復(fù)雜，可能涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)(如自主神經(jīng)、動脈壓力反射和中樞神經(jīng)系統(tǒng))和體液調(diào)節(jié)(如腎素-血管緊張素系統(tǒng))[3]。文獻報道，有高血壓家族史但血壓尚正常的年輕人，其血壓調(diào)節(jié)功能開始減弱，動脈壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)就已降低[4]。高血壓前期患者動脈壓力反射功能也低于正常血壓人群[5]。這些研究提示動脈壓力反射能力減退可能是高血壓前期進展到高血壓的重要機制。壓力反射功能減弱主要發(fā)生在壓力感受器和反射中樞。高血壓前期壓力感受器功能尚未改變時，壓力反射功能減弱主要與反射中樞異常有關(guān)。

以往研究表明，壓力反射中樞腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)激活和血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)升高是壓力反射功能降低的關(guān)鍵機制[6]。壓力反射中樞主要分布在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral medulla，RVLM)、孤束核(nucleus tract solitarius，NTS)和下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)。近年研究發(fā)現(xiàn)，高血壓時，RVLM中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2) 降低，而過表達ACE2能降低高血壓[7]。ACE2主要作用是降解AngⅡ生成Ang(1-7)， Ang(1-7) 與其受體 MAS結(jié)合，對抗AngⅡ作用[8]。新近發(fā)現(xiàn)，高血壓時RVLM和NTS腦區(qū)ACE2和MAS受體水平降低，運動訓(xùn)練可增強ACE2和MAS受體在RVLM中表達并增強NTS腦區(qū)MAS受體表達[9]。 Agarwal等[10]報道，運動訓(xùn)練降壓與上調(diào)高血壓大鼠RVLM及PVN腦區(qū)ACE2和MAS受體表達相關(guān)。這些研究結(jié)果提示，運動訓(xùn)練增強腦內(nèi)ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能可能是運動降壓的重要機制。但是，ACE2功能軸是否影響動脈壓力反射目前尚不清楚，高血壓前期運動訓(xùn)練對高血壓進展和中樞血壓調(diào)節(jié)的影響也鮮有報道。本研究旨在探討高血壓前期運動訓(xùn)練對高血壓進程、血壓調(diào)節(jié)以及中樞ACE2和MAS受體的影響，通過腦內(nèi)給予Ang(1-7)及其拮抗劑，探討ACE2-Ang(1-7)-MAS軸在延緩高血壓進展中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要儀器和試劑

FT-200動物跑臺、BL-420s機能實驗系統(tǒng)和BP-300無創(chuàng)血壓儀(成都泰盟科技有限公司)；68003單臂數(shù)字式腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；7500 PCR儀(ABI)；NanoDrop 2000核酸定量分析儀(Thermo)；垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。苯腎上腺素和Ang(1-7)(MCE)；A779(Genway)；SYBR試劑盒和PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)；β-actin、ACE2和MAS引物由上海生工公司合成；兔多克隆抗ACE2抗體(Santa Cruz)；兔多克隆抗MAS抗體(Alomone Labs)；兔多克隆抗GAPDH抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)；ECL發(fā)光液(GenView)。

2 方法

2.1動物及分組 5周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和正常血壓Wistar Kyoto(WKY)大鼠各20只均購自北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號為SCXK(京)2012-0001。將SHR和WKY大鼠分別隨機分成安靜(sedentary， Sed)組和運動訓(xùn)練(exercise training, ExT)組(WKY+Sed、WKY+ExT、SHR+Sed和SHR+ExT組)，每組10只。飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2.2運動訓(xùn)練 5周齡大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境 1 周，測量基礎(chǔ)血壓。6周齡運動訓(xùn)練組大鼠開始跑臺運動，采用本實驗室已建立的有氧運動方案[11]，運動組大鼠跑臺訓(xùn)練 60 min/d，18～20 m/min，每周訓(xùn)練5 d，共 20周。

2.3無創(chuàng)血壓測定 采用尾套法測定清醒狀態(tài)下大鼠尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，2 周測量1次。

2.4動脈壓力反射功能評估 運動結(jié)束后24 h～48 h，用氨基甲酸乙酯(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。股靜脈插管用于給藥，頸動脈插管記錄血壓和平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。靜脈注射苯腎上腺素(phenylephrine，PE；8 μg/kg)，引起血壓升高和反射性心率減慢，記錄注藥前后平均動脈壓變化(ΔMAP)和心率變化(ΔHR)，術(shù)畢穩(wěn)定30 min，檢測壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity，BRS)以評估動脈壓力反射功能，每組6只。BRS=ΔHR/ΔMAP[12]。

2.5側(cè)腦室微量注射 為了明確運動訓(xùn)練是否通過Ang(1-7)影響動脈壓力反射功能，在運動訓(xùn)練結(jié)束后，于側(cè)腦室分別注射MAS受體激動劑Ang(1-7)和拮抗劑A779，記錄給藥前后BRS變化，每組6只。側(cè)腦室注射點在前囟后0.8 mm，中線旁開1.4 mm，顱骨表面深3.8 mm。將微量注射器固定在三維操縱器上，側(cè)腦室給藥前，向側(cè)腦室注射生理鹽水(1 μL，3 min)作為對照，隨后靜脈注射PE，測定BRS。間隔20～30 min，然后側(cè)腦室緩慢注射MAS受體激動劑Ang (1-7)(4×10-7mol/L)和阻斷劑A779(5×10-7mol/L)，給藥體積10 μL，注射時間3～4 min，給藥結(jié)束后立即測定BRS。Ang(1-7)和A779給藥間隔30 min。

2.6Real-time PCR檢測ACE2和MAS的mRNA表達 根據(jù)大鼠腦圖譜進行定位[13]，取各組大鼠RVLM、NTS和PVN組織各100 mg，每組4只。Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR 采用SYBR Green 染料法，反應(yīng)總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 s、60℃ 34 s，共45個循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。引物見表1。

表1 Real-time PCR反應(yīng)的引物序列

2.7Western blot檢測ACE2和MAS的蛋白表達 取RVLM、NTS和PVN組織約50 mg，加入RIPA 裂解液(含PMSF和蛋白酶抑制劑)， 制成10%勻漿液，4 ℃ 12 000×g離心20 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量。每泳道上樣總蛋白50 μg，SDS-PAGE(12%分離膠、5%濃縮膠)后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用麗春紅染色，依相對分子質(zhì)量大小切取條帶，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。洗膜后分別加入 I 抗 [ACE2(1∶1 000)和MAS(1∶2 000)]4 ℃過夜。次日洗膜后分別加入相應(yīng)的ACE2 II 抗(1∶1 000)和MAS II 抗 (1∶3 000)，室溫下孵育2 h。洗膜后加入ECL 顯影，用凝膠成像儀掃描保存圖像。Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行條帶密度測定，以GAPDH作為內(nèi)參照，目的蛋白/GAPDH條帶密度比值表示目的蛋白表達水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，BRS比較采用析因設(shè)計方差分析，側(cè)腦室注藥前后BRS變化采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 運動訓(xùn)練對高血壓進展的影響

運動前SHR和WKY大鼠間 SBP差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。增齡過程中SHR+Sed組SBP逐漸升高，8周齡達(146.6±4.5)mmHg，同周齡SHR+ExT組SBP為(135.9±6.2)mmHg, 尚未進展為高血壓。SHR+ExT組10周齡進展為高血壓，SBP達(148.2±8.1)mmHg，但顯著低于同齡SHR+Sed組(P<0.05)。隨運動時間延長，SHR+ExT組SBP升高幅度明顯小于SHR+Sed組，20周運動結(jié)束時， SHR+ExT組SBP比SHR+Sed組明顯降低(P<0.01)。運動訓(xùn)練也降低WKY大鼠SBP，20周運動結(jié)束時， WKY+ExT組SBP亦明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The effects of 20 weeks exercise training on hypertension progression in SHR and WKY rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsWKY+Sed group;#P<0.05,##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖120周運動訓(xùn)練對大鼠高血壓進展的影響

2 運動訓(xùn)練對動脈壓力反射功能的影響

20周運動結(jié)束，SHR+Sed組的BRS明顯低于WKY+Sed組[(0.7 ± 0.1)vs(1.9 ± 0.1)；P<0.01]，但SHR+ExT組的BRS明顯高于SHR+Sed組[(1.6±0.1)vs(0.7 ± 0.1)；P<0.01]。WKY+ExT組的BRS與WKY+Sed組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

3 運動訓(xùn)練對壓力反射中樞ACE2和MAS mRNA及蛋白表達的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示， SHR+Sed組ACE2和 MAS的mRNA表達在RVLM、NTS和PVN等部位均明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)；與SHR+Sed組相比，運動訓(xùn)練顯著增強SHR ACE2和MAS的mRNA表達(P<0.05)；運動訓(xùn)練對WKY大鼠ACE2和MAS的mRNA表達無明顯影響，見表2。

表2 運動訓(xùn)練對壓力反射中樞ACE2和MAS mRNA表達的影響

*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

Western blot結(jié)果顯示， SHR+Sed組RVLM、NTS和PVN等部位ACE2和MAS的蛋白表達水平均明顯低于WKY+Sed組(P<0.05)；運動訓(xùn)練顯著增強SHR這3個部位的ACE2蛋白表達，使SHR+ExT組ACE2蛋白水平正常化；在NTS和PVN，SHR+ExT組的MAS蛋白表達不僅高于SHR+Sed組(P<0.01)，也高于WKY+Sed組(P<0.01)。運動訓(xùn)練對WKY大鼠這3個部分ACE2和MAS蛋白表達無明顯影響，見圖2～4。

Figure 2. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in RVLM. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖220周運動訓(xùn)練對RVLM中ACE2和MAS蛋白表達的影響

4 側(cè)腦室微量注射Ang(1-7)和A779對運動訓(xùn)練改善壓力反射功能的影響

SHR+ExT組大鼠側(cè)腦室注射A779后，對基礎(chǔ)血壓無明顯影響，但給藥后BRS較注藥前明顯降低(P<0.01)，抵消了運動改善SHR大鼠BRS的益處，但對SHR+Sed組大鼠的BRS無明顯影響。側(cè)腦室注射Ang(1-7)后可短暫降低SHR+Sed組和SHR+ExT組大鼠基礎(chǔ)血壓5 mmHg左右，與注藥前相比，Ang(1-7)明顯提高SHR+Sed組和SHR+ExT組的BRS(P<0.05)，見表3。

Figure 3. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in NTS. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05，**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖320周運動訓(xùn)練對NTS中ACE2和MAS蛋白表達的影響

Figure 4. The effects of 20-week exercise training on protein expression of ACE2 and MAS in PVN. A: WKY+Sed; B: WKY+ExT; C: SHR+Sed; D: SHR+ExT. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsWKY+Sed group;##P<0.01vsSHR+Sed group.

圖420周運動訓(xùn)練對PVN中ACE2和MAS蛋白表達的影響

表3Ang(1-7)和A779對SHRBRS的影響

Table 3. The effects of Ang (1-7) and A779 on BRS in SHR (Mean±SD.n=6)

GroupA779Ang(1-7)Pre-injectionPost-injectionPre-injectionPost-injectionSHR+Sed0.67±0.100.67±0.200.58±0.201.38±0.20**SHR+ExT1.55±0.100.77±0.20**1.24±0.201.82±0.30*

*P<0.05,**P<0.01vspre-injection in the same group.

討 論

1 運動訓(xùn)練對高血壓進展及血壓調(diào)節(jié)的影響

高血壓前期的治療以改變生活方式為主，有氧運動是主要治療措施[3]。其他學(xué)者和本課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)，適度運動具有降低血壓、改善壓力反射功能和減少高血壓危險因素等作用[12，14-15]，但運動訓(xùn)練對高血壓的預(yù)防作用及其機制報道甚少。本實驗以SHR大鼠為研究對象，于高血壓前期進行中低強度運動干預(yù)，并持續(xù)20周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運動訓(xùn)練能延緩高血壓發(fā)生時間窗，SHR運動訓(xùn)練組較SHR安靜組推遲2周進入高血壓。運動訓(xùn)練對SHR和WKY大鼠均有降壓作用，對高血壓大鼠的降壓作用大于正常大鼠，這一結(jié)果提示，始于高血壓前期的運動訓(xùn)練雖然不能阻止高血壓發(fā)生，但明顯推遲高血壓發(fā)生時間窗，并降低高血壓幅度。運動訓(xùn)練降壓機制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明。動脈壓力反射是體內(nèi)重要的血壓調(diào)節(jié)機制，運動訓(xùn)練恢復(fù)動脈壓力反射功能和改善壓力反射敏感性是運動降壓的關(guān)鍵機制[12, 15 ]。這是因為動脈壓力反射能適時監(jiān)測血壓變化，通過負(fù)反饋機制維持動脈血壓相對穩(wěn)定。對于正常人或高血壓前期人群，壓力反射功能受損增加患高血壓風(fēng)險。高血壓患者壓力反射功能減弱，血壓變異性增大，發(fā)生心腦血管意外事件風(fēng)險增加，提示預(yù)后不良[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，始于高血壓前期的運動訓(xùn)練也能增強動脈壓力反射功能，提高血壓調(diào)節(jié)作用，這可能是運動訓(xùn)練延緩高血壓進展的機制之一。

2 運動訓(xùn)練對壓力反射中樞ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能的影響

研究表明，腦內(nèi)RAS激活，AngⅡ興奮RVLM、PVN等處前交感神經(jīng)元，一方面交感神經(jīng)傳出活動增強，另一方面抑制壓力感受器傳入信號(感受器傳入信號抑制RVLM交感神經(jīng)活動)，升高血壓[5-6]。ACE2主要功能是降解AngⅡ生成Ang(1-7)，后者與MAS受體結(jié)合，構(gòu)成ACE2-Ang(1-7)-MAS軸，以對抗ACE-AngⅡ-AT1軸作用[8]。本研究觀察到SHR安靜組RVLM、NTS和PVN等處ACE2 mRNA表達較WKY安靜組降低約40%～60%， ACE2 蛋白表達也較WKY安靜組降低了35%～43%。 Yamazato等[7]也報道SHR RVLM處ACE2 mRNA較WKY明顯降低。運動訓(xùn)練顯著提高SHR ACE2 mRNA和蛋白表達，并使之正?；?。運動訓(xùn)練不僅上調(diào)心血管中樞ACE2表達，而且也增強主動脈[17]和心臟組織[18]ACE2表達。對于MAS受體，SHR安靜組上述3個部位MAS的mRNA和蛋白表達均明顯低于WKY安靜組，運動訓(xùn)練顯著上調(diào)SHR MAS的mRNA和蛋白表達，SHR運動組這3個部位的MAS 蛋白表達較SHR安靜組提高了1.0～1.5倍。Ren等[9]和Agarwal等[10]報道，高血壓大鼠進行12～16周運動訓(xùn)練后，不僅降低高血壓，而且增強ACE2和MAS在RVLM、NTS和PVN的表達， 但沒有觀察對壓力反射功能的影響。Lopes等[19]報道， 運動訓(xùn)練聯(lián)合ACE2激動劑能改善高血壓大鼠壓力反射功能。因此，其他學(xué)者和本實驗結(jié)果均提示，運動訓(xùn)練增強腦內(nèi) ACE2和MAS表達可能是運動訓(xùn)練改善高血壓大鼠壓力反射功能的分子機制。Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-MAS軸的樞紐，運動訓(xùn)練能增強心肌組織Ang(1-7)水平[18]。由于本實驗未檢測腦內(nèi)Ang(1-7)水平，為了解運動訓(xùn)練對Ang(1-7)影響，采用側(cè)腦室注射Ang(1-7) 拮抗劑A779，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A779抵消了運動改善SHR BRS的作用，而Ang(1-7)能提高SHR安靜組和運動訓(xùn)練組BRS。這一結(jié)果間接證明Ang (1-7)介導(dǎo)了運動訓(xùn)練改善壓力反射中樞調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明，始于高血壓前期的運動訓(xùn)練具有降低高血壓、改善動脈壓力反射功能及增強中樞ACE2-Ang(1-7)-MAS軸功能等作用，這可能是運動訓(xùn)練延緩高血壓進展的中樞機制。

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