谷軍保，鮑學(xué)斌，馬 釗

(河南省人民醫(yī)院胃腸外科，河南 鄭州 450003)

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤第2位[1]。胃癌的分子標(biāo)志物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，尋找與胃癌發(fā)病相關(guān)的新型靶向基因?qū)ζ漕A(yù)后評(píng)估及綜合治療有重要意義。XB130是一種新被識(shí)別的蛋白，在脾臟和甲狀腺中表達(dá)較高，而在腦、腎、肺和胰腺中表達(dá)較低[2]；XB130是一種腫瘤啟動(dòng)子，但在甲狀腺癌和人肺癌細(xì)胞系中XB130表達(dá)下調(diào)[2]。XB130不僅參與細(xì)胞增殖、存活，還參與信號(hào)傳遞，本身會(huì)受到Rac和細(xì)胞骨架的調(diào)控，參與c-Src通路的激活和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路活化，而這些通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，提示XB130在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中也起到一定作用[3-5]。本研究旨在探討XB130在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存期的關(guān)系，以期為胃癌的發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為胃癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源收集2011年6月至2012年6月河南省人民醫(yī)院保存的胃癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織>5 cm處)標(biāo)本各72例，男53例，女19例；年齡42～73歲，平均(58.3±6.2)歲；均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為胃癌，術(shù)前均未進(jìn)行放射治療和化學(xué)治療。

1.2儀器與試劑總RNA分離試劑盒(美國(guó)Promega公司)，TaqDNA聚合酶(美國(guó)Thermo公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物(上海生工生物工程股份有限公司)；組織破碎儀(德國(guó)Retsch公司)，低溫超速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Biorad公司)。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中XB130蛋白表達(dá)將石蠟切片置于二甲苯I、二甲苯II中各浸泡15 min；無(wú)水乙醇I、無(wú)水乙醇II及體積分?jǐn)?shù)90%、80%乙醇中各浸泡10 min；于100 ℃檸檬酸鹽溶液中抗原修復(fù)15 min；0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.4～7.6)沖洗3次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化氫-甲醇溶液中封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10～15 min；蒸餾水沖洗，PBS清洗3次，每次5 min；血清封閉液室溫封閉30 min；吸去封閉液，滴加一抗，4 ℃ 過(guò)夜；取出后室溫放置復(fù)溫20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃溫箱孵育45 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加50～100 μL二氨基聯(lián)苯胺顯色工作液顯色5～10 min；置于PBS中終止顯色；蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。隨機(jī)抽查5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色深度進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未染色為0分，<10%為1分，10%～49%為2分，50%～80%為3分，>80%為4分。將每張切片著色程度得分和陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分相乘即為最后得分，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～7分為陽(yáng)性(++)，8～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；將“-”定為陰性表達(dá)，“+”、“++”、“+++”定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2總RNA提取與純化取30 mg胃癌組織和癌旁組織研碎，放入裝有175 μL RNA裂解液的離心管中，充分混合后加入350 μL RNA 稀釋緩沖液，顛倒3～4次后在70 ℃下孵育3 min；室溫下13 000×g離心10 min；取澄清裂解液加入200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，混合后轉(zhuǎn)移到離心柱裝配體中，13 000 ×g離心1 min；在離心柱中加600 μL RNA 清洗液后13 000×g離心1 min；隨后將50 μL新鮮制備的脫氧核糖核酸酶孵育混合物直接加到離心柱內(nèi)的膜上；25 ℃下孵育15 min，加入終止液，13 000×g離心1 min；RNA 洗液洗滌2次后用100 μL無(wú)核酸酶水洗脫、收集。

1.3.3cDNA的合成取1 μg總RNA、4 μL MgCl2、2 μL 25 mmol·L-1反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液、2 μL 脫氧核糖核苷三磷酸混合液、0.5 μL 10 mmol·L-1重組核糖核酸酶抑制劑、0.5 μL通用引物、1 μL 禽成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶，加無(wú)核酸酶超純水使反轉(zhuǎn)錄體系至20 μL，對(duì)其進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄程序，混勻快速離心1次，反應(yīng)程序：42 ℃ 15 min、95 ℃ 5 min、4 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄的cDNA置于-40 ℃冰箱保存，備用。

1.3.4實(shí)時(shí)定量熒光PCR法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中XB130mRNA水平PCR體系包括8.2 μL無(wú)核水、10 μL PCR反應(yīng)混合物(含熒光染料)、1 μL cDNA和0.8 μL引物，整個(gè)體系為20 μL，95 ℃熱啟動(dòng)3 min；95 ℃變性3 s、60 ℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。XB130 RNA引物序列：上游為5′-AGGAAACCCTACTGAAATGCAC-3′，下游為5′-GCACT-CCTCG-TCAATTTCCT-3′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)RNA 引物序列：上游為5′-CATGGAGAAGGCTGG-GG-3′，下游為5′-AAAGTTGTCATGGATGA-CC-3′。采用Image-pro plus軟件(美國(guó)Media Cybernetics公司)對(duì)XB130 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1胃癌和癌旁組織中XB130蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖1。72例胃癌組織標(biāo)本中，XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá)26例，陰性表達(dá)46例，陽(yáng)性表達(dá)率36.1%(26/72)；72例癌旁組織標(biāo)本中，XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá)52例，陰性表達(dá)20例，陽(yáng)性表達(dá)率72.2%(52/72)；胃癌組織中XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織(χ2=16.200，P<0.05)。

A：胃癌組織；B：癌旁組織。

圖1胃癌和癌旁組織中XB130蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

Fig.1ExpressionofXB130proteiningastriccancertissuesandparacanceroustissues(immunohistochemistry，×200)

2.2XB130蛋白表達(dá)與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。低、中分化胃癌組織中XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于高分化胃癌癌組織(χ2=5.786，P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者胃癌組織中XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(χ2=4.281，P<0.05)。

表1XB130蛋白表達(dá)與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofXB130proteinandthedifferentiationandlymphnodemetastasisofgastriccancer

病理特征nXB130-/例(%)+/例(%)χ2P分化程度 低、中分化3024(80.0)6(20.0)5.7860.016 高分化4222(52.3)20(47.6)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有2822(78.6)6(21.4)4.2810.038 無(wú)4424(54.5)20(45.5)

2.3胃癌和癌旁組織中XB130mRNA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2。胃癌組織和癌旁組織中XB130 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.52±0.46、3.28±0.51，胃癌組織中XB130 mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(t=-21.744，P<0.05)。

圖2胃癌和癌旁組織中XB130mRNA的表達(dá)

Fig.2XB130mRNAexpressioningastriccancertissuesandparacanceroustissues

2.4XB130mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表2。高分化胃癌組織中XB130 mRNA表達(dá)顯著高于低、中分化胃癌組織(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者胃癌組織中XB130 mRNA表達(dá)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。

表2XB130mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5XB130mRNA高表達(dá)者與XB130mRNA低表達(dá)者生存期比較按照XB130 mRNA表達(dá)量中位數(shù)2.22進(jìn)行分組，高表達(dá)組36例，低表達(dá)組36例。高表達(dá)組患者的平均生存期為(37.040±14.826)個(gè)月，低表達(dá)組患者的平均生存期(21.529±11.789)個(gè)月，XB130 mRNA高表達(dá)胃癌患者的生存期顯著高于XB130低表達(dá)患者(t=9.121，P<0.05)；見(jiàn)圖3。

圖3XB130mRNA高表達(dá)患者與XB130低表達(dá)患者生存期比較

Fig.3ComparisonofthesurvivaltimebetweenthepatientswithhighandlowexpressionofXB130mRNA

3 討論

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是多因素多階段發(fā)展形成的，在危險(xiǎn)環(huán)境長(zhǎng)期暴露、幽門(mén)螺桿菌感染及飲食因素的共同作用下，胃黏膜細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多種活性因子，使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥損傷，增殖與凋亡之間的平衡被打破，最終形成胃癌組織[6]。目前，已經(jīng)證實(shí)的致癌基因有K-ras、p53、腺瘤性結(jié)腸息肉病基因、Bmi-1等[7-10]，但對(duì)于XB130與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究旨在探討胃癌組織和癌旁組織中XB130的表達(dá)及其與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存期的關(guān)系，以期為XB130在胃癌的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

XB130是一種新型接頭蛋白，位于染色體10q25.3，編碼由818個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量為130 000[3]。研究發(fā)現(xiàn)，XB130在人正常甲狀腺和脾臟組織中高表達(dá)，而在甲狀腺癌組織中低表達(dá)[11]。XB130可能是原癌基因，在正常組織中表達(dá)，可以維持正常細(xì)胞自我更新和遷移；同時(shí)，還有另外一套調(diào)控基因預(yù)防正常的細(xì)胞過(guò)度增殖和分化，當(dāng)平衡被打破后，細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移失控，產(chǎn)生致癌作用[12]。原癌基因經(jīng)典理論對(duì)正常組織中XB130高表達(dá)仍然保持“健康”做出了合理接受，眾所周知，基因和信號(hào)通路發(fā)揮致癌性或致病性作用依賴于上下分子的調(diào)控，所以同一基因可能會(huì)在不同組織類(lèi)型的癌癥或癌癥的不同階段中發(fā)揮不同的作用[13-14]。有研究對(duì)應(yīng)用氟尿嘧啶治療的胃癌患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)XB130的下調(diào)會(huì)降低氟尿嘧啶敏感性，XB130低表達(dá)患者的預(yù)后較差，XB130高表達(dá)患者的生存率高于低表達(dá)患者，XB130可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)錄通路發(fā)揮作用[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中XB130 蛋白和mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織；低、中分化腺癌組織中XB130表達(dá)低于高分化腺癌組織，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中XB130表達(dá)低于未伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；XB130高表達(dá)者生存期長(zhǎng)于XB130低表達(dá)者。以上結(jié)果表明，XB130在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮了抑制作用，胃癌的轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后與XB130表達(dá)水平密切相關(guān)。

綜上所述，XB130可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，調(diào)控XB130的表達(dá)有望成為胃癌靶向治療的新位點(diǎn)。

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