魯保才，盧振民，張愛民，余文發(fā)，連 榮，史海旭，李 靖，王慧敏，袁東杰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南 衛(wèi)輝 453100)

鼻咽癌是一種地方性高發(fā)的鼻咽部鱗狀上皮癌，常發(fā)生在鼻咽部頂壁和咽隱窩。主要治療方法是放射治療或放射治療聯(lián)合化學治療，但對于晚期病灶、轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)患者的治療效果很差，且不良反應(yīng)重[1]。鼻咽癌的發(fā)生是包括環(huán)境因素、癌基因、抑癌基因、基因的易感性、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)在內(nèi)的多因素作用的結(jié)果。因此，闡明鼻咽癌發(fā)生的分子機制及尋找新的治療靶點是該病治療的關(guān)鍵。趨化因子受體4(chemine receptor 4，CXCR4)是基質(zhì)細胞衍生因子1唯一的趨化因子受體，參與各種生理及病理過程[2]。近年來研究顯示，乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多種腫瘤中CXCR4高表達，其表達與腫瘤細胞的播散、正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細胞的非隨機轉(zhuǎn)移等有關(guān)[3-5]。也有研究指出，鼻咽癌中CXCR4也有高表達，其表達與鼻咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。本研究擬采用RNA干擾技術(shù)，通過靶向沉默人鼻咽癌細胞系CNE-2Z中CXCR4基因的表達，觀察其對鼻咽癌細胞增殖、侵襲的影響，并進一步研究其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料收集新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2014年1月至2016年12月保存的鼻咽癌及相應(yīng)的癌旁組織各42例，男28例，女14例，年齡19～85(42.2±12.1)歲。鼻咽癌患者經(jīng)病理證實均為鼻咽部低分化鱗癌，均未接受任何治療，且為首次確診，所有樣本的實驗均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2試劑和儀器人鼻咽癌細胞系CNE-2Z購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，Transwell小室購自美國Corning公司，細胞計數(shù)試劑盒 (cell counting kit-8，CCK-8)和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、細胞周期素D1(Cyclin D1)抗體均購自美國Abcam公司；多功能酶標儀(Synergy HT)購自美國Bio-Tec公司，流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(realtime-polymerasechainreaction，RT-PCR)檢測鼻咽癌及癌旁組織中CXCR4mRNA表達參照Trizol試劑盒操作說明提取患者鼻咽癌組織和癌旁組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照GenBank中的基因序列，利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計軟件設(shè)計目的基因CXCR4及內(nèi)參基因磷酸甘油醛脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的RT-PCR引物，送上海生工生物工程有限公司合成。CXCR4引物序列：上游為5′-TGGCCTTATCCTGCCTGGTAT-3′，下游為5′-GGAGTCGATGCTGATCCCAAT-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游為5′-GAAGATGGTGATGGGAT-TTC-3′。定量PCR擴增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，以上共35個循環(huán)。72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。根據(jù)相對模板量2-ΔΔCt計算CXCR4 mRNA相對表達量。

1.4細胞轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細胞系CNE-2Z在37 ℃，95%濕度，含體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的細胞，以1.0×108L-1接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長至孔底面積達85%～90%時進行轉(zhuǎn)染，分為空白對照組(細胞未做任何處理)、陰性對照組(細胞轉(zhuǎn)染無義siRNA序列)和CXCR4轉(zhuǎn)染組(細胞轉(zhuǎn)染CXCR4的靶向siRNA序列)。具體操作按照LipofectamineTM2000試劑盒的操作說明進行。

1.5Westernblot法檢測鼻咽癌組織、癌旁組織及各組細胞中CXCR4、MMP-2、MMP-9、β-catenin及CyclinD1蛋白表達用細胞裂解液分別處理鼻咽癌組織、癌旁組織和細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg上樣蛋白至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉，分別加入CXCR4、MMP-2、MMP-9、β-catenin、Cyclin D1(均按照1500稀釋)和GAPDH(11 000稀釋)一抗，4 ℃過夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌(3次×10 min)，加入 15 000 稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗鼠IgG，37 ℃ 孵育1 h，洗膜后在暗室X片曝光1 min左右，顯影、定影后成像拍照。

1.6CCK-8檢測細胞增殖能力以1×107L-1濃度將對數(shù)生長的CNE-2Z細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h進行同步化處理，分別于轉(zhuǎn)染后48 h每孔細胞中加入CCK-8試劑 10 μL，培養(yǎng)箱孵育1 h。酶標儀測定450 nm的吸光度，重復(fù)3次。細胞增殖率 =(轉(zhuǎn)染組細胞/對照組細胞)×100%。

1.7Transwell小室檢測細胞侵襲能力4 ℃融化Matrigel膠，與RPMI-1640培養(yǎng)液按照14比例稀釋，取50 μL稀釋后的膠鋪在Transwell小室上層。常溫放置10～15 min風干，轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞以每孔1×104個細胞接種于Transwell小室的上層，下室中加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h，洗滌，棉球輕輕擦掉上室內(nèi)的細胞，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗，隨機取不同的6個視野(×200)觀察；并記錄穿膜的細胞數(shù)，重復(fù)3次，求均值。

2 結(jié)果

2.1CXCR4mRNA和蛋白在鼻咽癌及癌旁組織中的表達結(jié)果見圖1。鼻咽癌及相應(yīng)的癌旁組織中CXCR4 mRNA表達分別為5.526±0.143、0.953±0.091，蛋白表達分別為0.522±0.047、0.053±0.011，鼻咽癌組織中CXCR4 mRNA及蛋白表達均顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：CXCR4 mRNA表達；B：CXCR4蛋白表達。

圖1CXCR4在鼻咽癌中的表達

Fig.1ExpressionofCXCR4inhumannasopharyngealcarcinomatissue

2.2轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后CNE-2Z細胞中CXCR4蛋白表達結(jié)果見圖2?？瞻讓φ战M、陰性對照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞中CXCR4蛋白表達分別為0.383±0.031、0.369±0.029和0.037±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞中CXCR4蛋白表達顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組細胞中CXCR4蛋白表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2各組CNE-2Z細胞中CXCR4蛋白表達

Fig.2ExpressionofCXCR4proteininCNE-2Zcellsineachgroup

2.3各組細胞增殖能力比較空白對照組、陰性對照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組的細胞存活率分別為(95.62±3.23)%、(93.45±3.13)%和(61.18±4.44)%，CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞存活率顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組細胞存活率與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4各組細胞侵襲能力比較空白對照組、陰性對照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞Transwell侵襲數(shù)分別為225±15、217±14和 102±12，MMP-2蛋白表達分別為0.475±0.042、0.498±0.041和0.223±0.027，MMP-9蛋白表達分別為0.481±0.036、0.462±0.034和0.330±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞侵襲數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達均顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組細胞侵襲數(shù)、MMP-2和MMP-9蛋白表達與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。MMP蛋白表達結(jié)果見圖3。

圖3各組CNE-2Z細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達

Fig.3ExpressionofMMP-2andMMP-9proteininCNE-2Zcellsineachgroup

2.5轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA對Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin和CyclinD1蛋白表達的影響結(jié)果見圖4。空白對照組、陰性對照組和CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞中β-catenin蛋白表達分別為0.412±0.036、0.407±0.038和0.174±0.025，Cyclin D1蛋白表達分別為0.153±0.021、0.145±0.022和0.036±0.010，CXCR4轉(zhuǎn)染組細胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表達均顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組細胞中β-catenin和Cyclin D1蛋白表達與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4各組CNE-2Z細胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表達

Fig.4Expressionofβ-cateninandCyclinD1proteininCNE-2Zcellsofeachgroup

3 討論

趨化因子及其受體在大部分腫瘤中有表達，其表達影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此，以趨化因子或其受體為靶點，通過抑制趨化因子受體的信號傳導(dǎo)而調(diào)節(jié)趨化因子系統(tǒng)的功能對于惡性腫瘤的防治具有重要意義。研究顯示，CXCR4是在組織中表達最廣泛的細胞趨化因子受體之一，與其配體結(jié)合激活后可形成假偽足，影響多種惡性腫瘤的生長、侵襲、遷移[7]。在多種惡性腫瘤中有CXCR4基因的異常表達[8-9]。研究顯示，抑制CXCR4基因的表達可顯著降低卵巢癌、胃癌、腎癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力[10-12]。CXCR4基因在鼻咽癌中也呈現(xiàn)高表達，其表達與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移、放射治療史有關(guān)，可作為判斷鼻咽癌預(yù)后的指標[13]。但CXCR4對鼻咽癌侵襲及其機制研究尚未清楚。RNA干擾是由RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默調(diào)控，具有高度的特異性和有效性，是研究基因功能有效的途徑[14]。

腫瘤細胞的侵襲能力是惡性腫瘤的一個重要生物學特性，也是治療失敗的重要因素。惡性腫瘤細胞的侵襲是由多步驟、多階段控制的復(fù)雜過程，其中細胞外基質(zhì)降解是侵襲的關(guān)鍵。MMPs可降解細胞外基質(zhì)及基膜中的大多數(shù)蛋白質(zhì)，在腫瘤中由于其表達增強，促進細胞外基質(zhì)降解，進而增強細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力[15-16]。MMP-2和MMP-9在MMPs家族中研究的較多，既往研究表明，鼻咽癌中MMP-2和MMP-9過表達與鼻咽癌的浸潤生長、淋巴轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后等有關(guān)，抑制其表達可降低鼻咽癌細胞的侵襲和遷移能力[17-18]。本實驗通過轉(zhuǎn)染CXCR-4-siRNA抑制鼻嗯癌細胞中CXCR4 mRNA和蛋白水平，抑制了MMP-2和MMP-9的表達，顯著降低了鼻咽癌細胞的侵襲能力，提示CXCR4基因在鼻咽癌的侵襲能力可能與其調(diào)控MMP-2和MMP-9密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號通路由Wnt蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、跨膜受體胞質(zhì)蛋白和下游的靶基因組成，是一條經(jīng)典的Wnt信號通路，與腫瘤、衰老和退化、骨質(zhì)疏松等疾病有關(guān)[19]。β-catenin是Wnt信號通路的核心原件，在細胞膜及細胞質(zhì)中均有分布，當有Wnt信號刺激時，可導(dǎo)致β-catenin的大量聚集并進入細胞核，最終激活和啟動下游的Cyclin D1、c-myc基因的表達，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。既往研究認為，抑制Wnt/β-catenin信號通路可降低人鼻咽癌細胞的增殖、侵襲，促進細胞的凋亡能力[20]。本研究結(jié)果提示，抑制CXCR4表達后β-catenin、Cyclin D1蛋白表達水平顯著降低，同時鼻咽癌細胞的增殖和侵襲能力也對應(yīng)降低。因此，CXCR4基因可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與到鼻咽癌細胞的惡性增殖和侵襲能力的調(diào)控；另外，本研究也觀察到鼻咽癌細胞的惡性侵襲能力與MMP-2和MMP-9表達相關(guān)，但其具體調(diào)控方式和機制仍需進一步探討。

綜上所述，抑制鼻咽癌CXCR4表達可通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路來降低鼻咽癌細胞的增殖及侵襲能力。CXCR4基因可能成為鼻咽癌檢測的一個重要指標及作為分子治療的潛在靶點，但其作用機制仍需進一步深入研究。

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