崔子龍 ，常衛(wèi)華 ，2，王娟紅 ，2

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木兵團(tuán)畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

性別決定基因（sex region ofY chromosome，SRY）和性控技術(shù)的研究進(jìn)展及研究成果是最近幾年來學(xué)者們在性別發(fā)育和分化、性別控制等研究領(lǐng)域中取得的最大突破性成果。20世紀(jì)60年代以前，在性別決定和性別分化領(lǐng)域的研究仍舊是一個空白，許多問題仍是個迷，但隨著發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等交叉學(xué)科和新技術(shù)的快速發(fā)展，這些問題被逐步剝?nèi)訉由衩孛婕?，在染色體及DNA水平上逐漸進(jìn)行深入研究，許多調(diào)控機(jī)理逐漸得到闡明。Y染色體性別決定區(qū)即SRY基因是哺乳動物雄性的性別決定基因，具有較高的進(jìn)化保守性，包含整個完整的性別進(jìn)化信息，SRY基因位于性染色體Y上、靠近擬常染色質(zhì)區(qū)的非重組區(qū)域。SRY基因是雄性動物睪丸決定因子的最佳候選基因，目前，該基因已經(jīng)成為研究動物父系起源及系統(tǒng)分類的重要分子標(biāo)記之一［1-3］。通過對SRY基因的定性或定量檢測能夠做到特異而快速地判定動物后代性別，可以為優(yōu)良種畜的快速擴(kuò)繁提供基礎(chǔ)。

1 SRY基因功能研究

SRY基因是人及動物Y染色體上性別決定的核苷酸序列，是主宰性別的TDF睪丸決定因子（testis determining factor，TDF）的遺傳基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，SRY性別決定基因在動物胚胎期睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞和足細(xì)胞中產(chǎn)生SRY1因子，該細(xì)胞因子可以激活下游啟動子，從而使下游的繆勒氏體對MIS（miilerian inhibiting substance，MIS）基因的表達(dá)起到抑制作用，進(jìn)而調(diào)控繆勒氏管發(fā)育；同時，SRY1細(xì)胞因子還可作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，促使間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育并分泌雄性激素，進(jìn)而使動物產(chǎn)生雄性組織器官，向雄性動物個體發(fā)育。動物機(jī)體一旦缺少SRY或攜帶的SRY性別決定基因處于沉默，則性染色體X短臂上的DSS基因（逆性別劑量敏感基因）就會啟動轉(zhuǎn)錄程序，促進(jìn)卵巢等雌性器官的出現(xiàn)，進(jìn)而使機(jī)體向雌性動物個體發(fā)育。如果將XX型和XY型早期胚胎人工融合成XX-XY嵌合體，就會發(fā)現(xiàn)睪丸組織內(nèi)性染色體結(jié)構(gòu)中的支持細(xì)胞幾乎均為XY型，但在其他性腺組織細(xì)胞中，XY型和XX型細(xì)胞的比例與早期胚胎其他組織中檢測的比例基本一致，分析表明TDF因子在支持細(xì)胞前體中具有自主調(diào)節(jié)作用。目前，研究進(jìn)展及研究成果揭示哺乳動物的性別發(fā)育及性別決定是一個多層次、多基因調(diào)控過程，SRY基因不是性別決定的唯一基因，但動物的性別決定是以性控基因SRY為主導(dǎo)、多基因共同參與的一個有序調(diào)控過程。有研究發(fā)現(xiàn)，SRY、MIS、SOX9、WT-1、DAX-1、SF-1六種基因參與了調(diào)控胚胎在性別決定中由未分化原始生殖嵴到兩性內(nèi)生殖器官形成的過程，且該過程中起最重要作用的是SOX9基因［4-5］，其所表達(dá)的蛋白功能與SRY基因所表達(dá)的蛋白功能相似［6-7］。Koopman研究證實，即使在SRY基因缺失的情況下，SOX9基因仍能誘導(dǎo)早期胚胎向雄性分化，而且該基因的存在可保證雄性的發(fā)育能夠正常進(jìn)行［8］。最近研究結(jié)果顯示，SRY下游基因?qū)游镄韵俜只恼{(diào)控作用與該基因的表達(dá)量有關(guān)，基因的過度表達(dá)或表達(dá)不足均能引起性別分化。研究發(fā)現(xiàn)，SRY基因在人、豬、黑猩猩、鼠、犬、山羊、綿羊、牛、水牛、馬等15種物種中呈高度保守，而且它們的進(jìn)化關(guān)系非常相近［9］。2017 年，Song 等［1］研究證實 Sp1 為 SRY 轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控因子，SRY 5’側(cè)翼區(qū)Sp1基因的突變導(dǎo)致兔子性反轉(zhuǎn)，而且Tatsuo等［10］指出在個體發(fā)育過程中，或者由于某些疾病使SRY基因異常激活，導(dǎo)致機(jī)體生殖器官出現(xiàn)兩性生理。

總之，從SRY性控基因的發(fā)現(xiàn)至今不到30年的時間里，生物領(lǐng)域中學(xué)者們在該領(lǐng)域已經(jīng)開展了多方向深入細(xì)致的研究，并且取得了很大的進(jìn)展，通過對SRY基因多層次、多領(lǐng)域的研究，使人們對SRY基因的功能有了更深入的認(rèn)識，尤其是在性別鑒別及性別控制等方面其意義重大。

2 SRY基因中的SOX結(jié)構(gòu)及功能

1990 年，Sinclair等［11］首次在哺乳動物性腺中發(fā)現(xiàn)SRY基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因位于性染色體Y短臂擬常染色質(zhì)區(qū)，單一外顯子，長度850 bp，為一性別控制基因。性控SRY基因含有一個開放閱讀框（open reading frame，ORF），其中包含能與DNA序列相結(jié)合的HMG-box基序，后來科學(xué)家把那些在HMG-box區(qū)與SRY/Sry產(chǎn)物在氨基酸序列編碼的基因相似性達(dá)到60%以上的基因通稱為SOX（SRY related HMG—box gene，SOX）基因［2-3］。根據(jù)HMG-box結(jié)構(gòu)序列保守性，SOX基因家族分兩大類：一類是含有多重HMG-box基序，即含有兩個或兩個以上的HMG-box基序，這一類包含有連接因子UBF及線粒體轉(zhuǎn)錄因子l（MT-TF1），他們與DNA呈非特異性結(jié)合；另一類是以TGF、Sox、MATA等為代表，他們均含單個的HMG基序，并且是以序列特異性的方式與靶 DNA 相結(jié)合［12-13］。

研究表明，Sox基因家族成員中SRY/Sry基因只在哺乳動物性腺中表達(dá)，對雄性動物睪丸的發(fā)育起決定性的作用。研究人員發(fā)現(xiàn)，Sry基因在小鼠第10.5天到第12天的胚胎生殖嵴的某些細(xì)胞中表達(dá)，而且Sry基因具有促使生殖嵴細(xì)胞向足細(xì)胞分化的作用。一般研究者認(rèn)為是足細(xì)胞引導(dǎo)了性腺向雄性生殖器官的方向發(fā)展。但值得注意的是SRY/Sry基因在HMG-Box序列以外的區(qū)域中保守性相對較低。2010年，Pascal and Harley研究發(fā)現(xiàn)，雖然SRY/Sry基因在人類和小鼠中都有性別決定的功能，但兩種物種中SRY/Sry基因的氨基酸序列卻存在著較大的差異［14］。Sox3基因是哺乳動物性染色體Y上與SRY/Sry基因相似程度最高的基因，大部分研究學(xué)者認(rèn)為這兩個基因其實是同一基因的不同等位基因。但與SRY/Sry基因不同，雖然Sox3基因也在動物胚胎發(fā)育早期的泌尿生殖嵴中表達(dá)，但Sox3基因的表達(dá)模式與早期胚胎的性別分化無關(guān)，該基因主要與胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)［15］。另外，E亞族中的Sox8基因和Sox9基因也均與動物睪丸組織的形成有關(guān)，并且研究發(fā)現(xiàn)Sox8和Sox9基因在功能上有著重疊現(xiàn)象。Sox8基因?qū)υ缙谔翰G丸發(fā)育的影響較小。研究證實，如果小鼠中僅有Sox8基因表達(dá)缺陷，則小鼠睪丸的正常發(fā)育不會受到影響［16］。而Sox9基因在動物生殖嵴中的表達(dá)模式則受SRY/Sry影響，早期該基因在雌雄生殖嵴中均可表達(dá)，但SRY/Sry基因表達(dá)開始后，Sox9基因則只在雄性生殖嵴中表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)足細(xì)胞的發(fā)育，因此，Sox9基因也被稱為足細(xì)胞分化因子［17］。SOX基因家族中，除Sry、Sox3、Sox9之外，F(xiàn) 組中的Sox17，D 組的Sox5、Sox6等，均與小鼠睪丸中精細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)［18］。

可見，研究SRY基因中SOX基因可以揭示動物性別決定與性別分化的分子機(jī)制［19］，對性別決定機(jī)制的認(rèn)識、對性別控制理論的研究及目前性控理論的提升均具有非常重要的作用，為新的性控技術(shù)的開發(fā)及研究提供基礎(chǔ)。

3 反芻動物性別控制最新研究進(jìn)展

動物性別控制技術(shù)研究是很早就被科學(xué)家重視和研究的一項重大理論和實踐性課題，是通過對家畜正常生殖生理過程進(jìn)行人為地干涉或操作，在生產(chǎn)中使動物能夠按人們的意愿產(chǎn)出所需性別后代的一門繁殖新技術(shù)。通過性別控制技術(shù)，使公畜的生長優(yōu)勢和母畜的繁殖潛力能夠發(fā)揮到最大限度，從而在生產(chǎn)上增加畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)畜牧業(yè)的快速發(fā)展；同時，可以消除對畜群發(fā)展不利的基因或基因型，從而防止性連鎖疾病的發(fā)生；還可以提高優(yōu)良種群的繁殖潛力，加快種畜群更新?lián)Q代的速度、縮短繁殖周期，進(jìn)而促進(jìn)動物新品種的選育。

反芻動物早期胚胎性別鑒定一般是在胚胎移植前進(jìn)行的，從中選出所需性別的早期胚胎進(jìn)行移植，進(jìn)而控制或改變后代中性別比例，獲得所需后代。SRY基因發(fā)現(xiàn)之前，已有多種方法用于早期胚胎的性別鑒定，比如核型分析法、染色體染色法、H-Y抗原檢測法、激素分析法、X2相關(guān)酶檢測法［20］及胚胎細(xì)胞毒性分析法等，這些方法各有優(yōu)缺點，準(zhǔn)確率也千差萬別。而SRY基因的發(fā)現(xiàn)，為家畜早期胚胎性別鑒定提供了新方法，其就是通過檢測性染色體Y上是否含有SRY基因而確定性別，該方法靈敏度高，精確度高，準(zhǔn)確率可達(dá)90%以上，具有非常廣泛的應(yīng)用前景［21］。1987年，Leonard等報道首次成功地用標(biāo)記的牛染色體特異性探針鑒定牛囊胚期胚胎性別，準(zhǔn)確率95%。呂文發(fā)等［23］以PCR擴(kuò)增技術(shù)對牛、羊胚胎性別進(jìn)行了初步研究，他們以SRY基因序列自行設(shè)計了3對常規(guī)PCR引物，然后擴(kuò)增牛的SRY基因和羊的SRY基因，實驗結(jié)果證實，其中1對引物可用于牛和羊的早期胚胎性別鑒定。張秀華等［23］利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增綿羊X、Y染色體上的4個微衛(wèi)星標(biāo)記和SRY基因，并進(jìn)行性別鑒定。實驗結(jié)果證實，所設(shè)計SRY基因的引物具有高度特異性，是性別鑒定的主要依據(jù)。白文林等［24］利用巢式PCR建立了中國荷斯坦牛胚胎性別鑒定體系，他們采用巢式引物，該方法在很大程度上突顯了PCR產(chǎn)物的特異性，在一定程度上增加了實驗準(zhǔn)確率和數(shù)據(jù)可靠性。席繼鋒等［25］利用巢式PCR擴(kuò)增不同發(fā)育階段奶牛胚胎的SRY基因進(jìn)行性別鑒定，平均準(zhǔn)確率80%，隨著月齡的增加，準(zhǔn)確率也越來越高，其中4～8月齡準(zhǔn)確率達(dá)92.3%。宋淑珍等［26］以公羊和母羊肝組織為材料進(jìn)行巢式PCR，結(jié)果顯示公羊同時出現(xiàn)β-B-珠蛋白基因和SRY基因片段，而母羊只有常染色體基因片段。2011年，張大偉等［27］對牦牛性別鑒定進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，血液樣本性別鑒定與實際性別完全相符，準(zhǔn)確率100%。同時對早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，其中雄性占45.8%，而雌性比例為54.2%，取樣后胚胎發(fā)育率56.7%，該研究成功建立了牦牛胚胎性別鑒定的PCR體系。2016年，Saberivand等［28］以妊娠綿羊血清為材料，通過巢式PCR同時擴(kuò)增SRY和AMEL基因，得出同時出現(xiàn)2個條帶者為雄性胎兒，只出現(xiàn)一個條帶者為雌性胎兒，該方法在動物性別鑒定方面方便快速，對胎兒不造成損失，但不實用于雙胎妊娠。

通過近幾十年的發(fā)展，反芻動物性別控制技術(shù)取得了飛速發(fā)展，有些學(xué)者在牛羊等反芻動物上建立了相對比較穩(wěn)定的PCR性別鑒定體系，然而由于技術(shù)和理論的限制，目前的性別鑒定方法相對比較單一，性別控制技術(shù)還有待進(jìn)一步提升和完善。

4 展望

人類和其他哺乳動物的性別決定是以SRY基因為主導(dǎo)，多個基因共同參與調(diào)控的精細(xì)過程。自SRY性別決定基因最早被發(fā)現(xiàn)以來，有關(guān)SRY的研究日益增多，發(fā)現(xiàn)SRY基因在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中誘導(dǎo)睪丸分化，在哺乳動物的性別決定和分化中起到重要作用，研究已經(jīng)涉及爬行類、兩棲類、魚類、哺乳類等大多數(shù)動物，但研究方法比較單一，一般只是對單個SRY基因的克隆、測序和表達(dá)，更為深入細(xì)致的研究相對較少，尤其是對于反芻動物SRY基因與其他性控基因相互作用的報道更顯不足。在過去十幾年內(nèi)，人們已經(jīng)對SRY基因的表達(dá)模式、SRY蛋白如何發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)及基因與蛋白之間的相互作用有了初步的認(rèn)識，但對于性腺發(fā)育和性腺分化的分子調(diào)控機(jī)制了解還比較少，需進(jìn)一步的研究與探討。相信隨著科技的大發(fā)展及對SRY基因及其他與性別調(diào)控有關(guān)基因的深入細(xì)致的研究，科學(xué)家們一定會揭開反芻動物性別決定的神秘面紗，一些新的性控技術(shù)將用于指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

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