王娟紅 ，臧 明 ，鄭毛亮 ，常衛(wèi)華

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木兵團畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3.河南省武陟縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，武陟 454950）

母羊胎產(chǎn)羔數(shù)和發(fā)情次數(shù)是衡量綿羊高產(chǎn)的兩個重要指標。綿羊常年發(fā)情或季節(jié)性發(fā)情是一個復雜的調(diào)控過程，除激素外，一些主效基因或蛋白對其也起到關(guān)鍵的作用。近年來，隨著分子生物技術(shù)的高速發(fā)展，有關(guān)綿羊發(fā)情的分子方面的研究也越來越深入，綿羊的發(fā)情研究已從最初對少量主效基因的研究發(fā)展到轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學水平上的研究［1-6］。本文對近年來利用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學技術(shù)對綿羊繁殖調(diào)控方面的研究作一總結(jié)和分析，為同行提供一定參考。

1 綿羊重要繁殖特性基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄組學研究進展

轉(zhuǎn)錄組學（transcriptome）是指在某一生理條件下，機體細胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括小RNA（small RNAs，sRNA）、信使 RNA（mRNA）及一小部分基因間區(qū)和基因區(qū)的非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）。目前應用于轉(zhuǎn)錄組學的技術(shù)有：表達序列標簽、DNA微陣列技術(shù)、基因表達序列分析以及全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序。2005年以來，新一代高通量測序技術(shù)相繼誕生，包括Illumina/Solexa測序、ABI/SOLiD和 Roche/454測序等，這些高新技術(shù)為主效基因的挖掘及功能研究提供了更為廣闊的平臺。

朱廣琴［7］通過SSH技術(shù)構(gòu)建文庫的方法從奶山羊發(fā)情期卵巢中篩選出DCN、OAZ1、EPHX1和FSHR基因，實時定量PCR及生物信息學分析證實這些卵巢內(nèi)基因均與母羊產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。有研究利用RNA-seq技術(shù)獲得了小尾寒羊不同繁殖狀態(tài)下的基因表達模式，提出TGF-β信號通路中FSTL3、SMAD1、SMAD4和TGFBRII基因及胰島素信號通路中的BAD基因可能對常年發(fā)情有一定的調(diào)控作用。研究證實，卵巢卵泡液含有高濃度的褪黑素，而且在顆粒細胞內(nèi)有褪黑素受體的表達，對卵巢功能具有一定的調(diào)控作用［8-10］。Di等［11］通過高通量測序技術(shù)對發(fā)情季節(jié)的灘羊和小尾寒羊卵巢進行了miRNA研究，鑒別出183條不同miRNA家族的483條miRNA，在乏情期其中25個表達差異顯著，對發(fā)情具有重要的調(diào)控作用。Shi等［12］對濟寧青山羊卵巢研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α和β、孕酮受體mRNA的表達具時空特異性，該差異性與繁殖特點有關(guān)。Aungier等［13］研究證實，GnRH調(diào)控著E2濃度的增加與發(fā)情活動之間的關(guān)系，E2波峰后隨濃度增加，仍有90%以上動物保持發(fā)情行為。Ling等［14］研究指出，F(xiàn)ER1L4、SRD5A2基因在安徽白山羊和布爾羊不同組織中表達模式不同，推測該基因可能與安徽白山羊的多胎性有關(guān)。Chang等［15］利用高通量測序技術(shù)對甘肅高山細毛羊黃體期卵巢小RNA進行了研究，獲得9321775條cleanreads和267條候選miRNA，研究證實候選miRNA Ovis_aries_ovary-m0033_3p 為卵巢特異性 miRNA。Miao 等［16］通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了不同品種綿羊mRNA與miRNA的表達水平，其研究結(jié)果有助于鑒別繁殖調(diào)控相關(guān)候選基因。Abadjieva 等［17］研究證實，GDF9 和 BMP15 在卵巢和顆粒細胞內(nèi)表達，而且蒺藜皂甙可以改變GDF9和BMP15在兔子卵巢和F1雌性后代中的表達模式。Chang等［18］研究指出，BMPs/GDFs是卵泡形成及卵巢功能的重要因子，調(diào)控生殖疾病及不育等通路信號。Yang等［19］研究指出，非發(fā)情季節(jié)在生殖內(nèi)分泌及卵巢生理系統(tǒng)中PLA2G4D能直接調(diào)控卵泡發(fā)育，間接影響瘦素的分泌。Yang 等［20］研究表明，chemerin/GPR1 信號通路在卵泡發(fā)育、黃體形成和黃體溶解中直接或間接調(diào)控孕激素的合成及分泌。黃冬維等［21］研究發(fā)現(xiàn)，2型脫碘酶基因（type Ⅱiodothyronine deiodinase gene，DIO2）和3型脫碘酶基因（type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）與羊的季節(jié)性發(fā)情調(diào)控有關(guān)，而且DIO3基因可能負調(diào)控發(fā)情活動。付紹印等［22］通過比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活性的配體－受體相互作用信號通路在下丘腦－垂體－卵巢性腺軸調(diào)控排卵及卵泡發(fā)育方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，篩選了影響產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)基因，豐富和補充了綿羊基因組信息。

從文獻報道來看，卵巢上的一些關(guān)鍵基因?qū)β殉不顒蛹肮δ艿陌l(fā)揮起著非常重要的作用，而通過轉(zhuǎn)錄組學可以篩選到一些調(diào)控的關(guān)鍵基因［23-25］，尤其是在多浪羊常年發(fā)情主效基因的篩選上意義重大。

2 綿羊重要繁殖特性調(diào)控蛋白組學研究進展

Wilkins和Williams于1994年第一次提出蛋白質(zhì)組（proteome）這一概念，但直到1995年7月，蛋白質(zhì)組這一概念才在《Electrophoresis》雜志上出現(xiàn)，當時對蛋白質(zhì)組概念定義為基因組所表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式［26］。經(jīng)過二十幾年的發(fā)展，現(xiàn)在的研究學者普遍認為蛋白質(zhì)組是一個基因組、一種生物、一種細胞或一種組織所表達的全部蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)組學是后基因組時代的一門新興學科，指基因組在某個細胞或某種組織中表達的全部蛋白質(zhì)及其存在方式，目的是從蛋白質(zhì)層面揭示生物體的生理本質(zhì)和生命活動規(guī)律，重點在于對蛋白質(zhì)進行定量研究。而定量研究主要分為2個方面，一是基于凝膠技術(shù)的研究方法（如2-DE和2D-DIGE技術(shù)）和基于質(zhì)譜技術(shù)的研究（如iTRAQ/SILAC、Label free和SRM/MRM）。其中同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ，isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是一種新的、功能強大的相對和絕對定量研究的方法，由美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）開發(fā)，該技術(shù)具有高精確性、高效率，而且重復性好，可以在一次串聯(lián)質(zhì)譜實驗中同時比較4個、多可達8個樣品中蛋白的相對含量。

Hamelin等［27］以比利時特塞爾綿羊品種為研究對象，調(diào)查了數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）引起的綿羊肌肉肥大是否對肌漿蛋白的表達產(chǎn)生影響，研究發(fā)現(xiàn)，只有α抗胰蛋白酶（Alpha-1-antitrypsin）在4種類型的肌肉中表達水平相似。預測這些蛋白可作為綿羊肌肉肥大的標志性蛋白，同時對研究正常肌肉的發(fā)育機制具有重要意義。Jia等［28］以綿羊卵巢組織為研究對象，建立了卵巢蛋白雙向凝膠電泳（2-DE）最佳體系，對卵巢蛋白提取與處理、樣品上樣量以及等點聚焦電壓、時間等條件做了優(yōu)化，為其他動物卵巢組織的處理及2-DE提供了參考。Soleilhavoup等［29］報道，在黃體期，大量蛋白如血漿銅藍蛋白、乳鐵蛋白，DMBT1及PIGR與免疫系統(tǒng)有關(guān)，CD9和腓骨蛋白均與組織重構(gòu)有關(guān)，而且myosin 9和纖維連接蛋白在發(fā)情期和黃體表面明顯不同。2016年陳瀟飛［30］利用iTRAQ蛋白表達譜共篩選到綿羊角蛋白2 356個，其中置信區(qū)間蛋白1 345個。正常兩角與畸形角組共137個差異表達蛋白，正常多角與畸形角組共91個差異表達蛋白，兩角與多角組共66個差異表達蛋白。正常角與畸形角組的差異蛋白主要富集在細胞外基質(zhì)、組織發(fā)育、細胞外基質(zhì)分解代謝和膠原蛋白代謝等過程；兩角與多角組主要富集在細胞分泌和細胞外基質(zhì)分泌等過程。同時利用Western Blotting和Q-PCR分別對iTRAQ結(jié)果進行驗證，結(jié)果表明，使用蛋白表達譜iTRAQ技術(shù)篩選綿羊相關(guān)差異蛋白具有可靠性及準確性。Miao等［31］通過iTRAQ技術(shù)分析了小尾寒羊和無角陶賽特母羊卵巢蛋白，鑒別了上萬個差異蛋白，GO和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白與氧化還原酶、細胞色素C氧化酶及載體等活性有關(guān)，該研究結(jié)果為小尾寒羊高繁殖力分子調(diào)控機理的理解提供基礎(chǔ)。

可見，通過蛋白組學技術(shù)對綿羊重要繁殖調(diào)控細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)組成、表達水平、修飾情況以及蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系等進行系統(tǒng)的分析，可以篩選到部分關(guān)鍵候選蛋白，而這些蛋白在綿羊重要繁殖性狀及組織功能的發(fā)揮方面具有非常重要的作用，將在轉(zhuǎn)錄后揭示蛋白質(zhì)與綿羊繁殖調(diào)控活動的內(nèi)在聯(lián)系和規(guī)律，為研究多浪羊等綿羊常年發(fā)情的繁殖機理提供基礎(chǔ)。

3 轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學的關(guān)聯(lián)分析

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是生物體最基礎(chǔ)、最主要的一種調(diào)控方式，在動物正常生長發(fā)育、抗病、組織器官功能的發(fā)揮及應激反應等過程中，細胞、組織等主效基因表達模式會發(fā)生顯著變化。與基因組等其他組學相比，轉(zhuǎn)錄組研究的是機體某一組織或細胞中表達的全部RNA，包括mRNA、小RNA及小部分非編碼RNA等，直接反映了組織或細胞主效基因表達模式的變化水平，而且轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果不含內(nèi)含子，測序數(shù)據(jù)分析方便。轉(zhuǎn)錄組學為研究機體內(nèi)組織或細胞基因表達及調(diào)控提供了重要的技術(shù)和方法，同時也為主效基因或功能基因的挖掘提供了重要途徑，是連接蛋白質(zhì)組生物功能和基因組遺傳信息的紐帶［32］。相比而言，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)相對較少，而且需要相應轉(zhuǎn)錄組信息給予驗證。目前，蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果的精確度及準確度比轉(zhuǎn)錄組要低一到兩個數(shù)量級，組織或細胞內(nèi)表達豐度比較低的一些蛋白現(xiàn)有技術(shù)無法檢測到；而且目前獲得的大部分轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)相關(guān)性比較差。因此，需要將二者的研究結(jié)果或數(shù)據(jù)相互關(guān)聯(lián)，以進一步揭示功能基因或主效基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制。Chalmel等［33］論述了在精子形成過程中，蛋白組學和轉(zhuǎn)錄組學的關(guān)聯(lián)性及利用RNA-seq高通量測序轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和MS-based蛋白組學技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)新的蛋白編碼基因及新的蛋白亞型的表達。

對轉(zhuǎn)錄組學分析獲得的差異基因和同位素標記相對和絕對定量技術(shù)篩選的差異蛋白進行二者關(guān)聯(lián)性分析，當組織或細胞內(nèi)某個蛋白被鑒定到而且在轉(zhuǎn)錄組水平上有表達信息時，被認為關(guān)聯(lián)到，然后分析二者之間的相關(guān)性；通過對多浪羊繁殖及調(diào)控組織進行蛋白質(zhì)定量及其關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄本作關(guān)聯(lián)聚類分析及蛋白相互作用網(wǎng)絡分析，獲得調(diào)控多浪羊常年發(fā)情的主效基因。目前，雖然轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學研究的比較多，但是二者之間的關(guān)聯(lián)性分析仍然很少，尤其是對新疆特有品種——多浪羊常年發(fā)情的調(diào)控機理研究尚屬首次。

4 總結(jié)和展望

基因和蛋白質(zhì)如何通過相互作用而調(diào)控相應生理活動，仍然是生物學家目前研究的熱點問題。綿羊發(fā)情調(diào)控是個錯綜復雜的過程，并且受到一些主效基因的調(diào)控，而且這種調(diào)控作用研究非常少，隨著科學技術(shù)的進展并通過逐步研究，相關(guān)的外部主要調(diào)控靶點及調(diào)控機理將會逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)。目前，轉(zhuǎn)錄組學的研究方法發(fā)展非常迅速，相應技術(shù)已經(jīng)相當成熟，而蛋白組學仍處在不斷的成長、發(fā)展及完善階段，對于生物樣品中低拷貝的蛋白質(zhì)目前仍舊無法擴增。隨著高端儀器及科學技術(shù)的不斷發(fā)展，獲得的不同物種、不同組織器官的蛋白組數(shù)據(jù)也越來越多。而且，由于諸如同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）新型蛋白定量技術(shù)的出現(xiàn)，蛋白質(zhì)的量化精確度也越來越高。轉(zhuǎn)錄后修飾技術(shù)如磷酸化研究發(fā)展迅猛，而且蛋白糖基修飾技術(shù)近幾年也發(fā)展迅猛，但這些技術(shù)方法由于專業(yè)性強，對人員要求高，因此，應用明顯受到限制，相對于透徹的轉(zhuǎn)錄組學分析其科研成果還遠遠不夠。隨著轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學數(shù)據(jù)之間的互補及驗證，二者的聯(lián)合分析在多浪羊等綿羊常年發(fā)情領(lǐng)域主效基因的挖掘及功能研究的應用方面會越來越廣泛，再結(jié)合內(nèi)分泌研究，其常年發(fā)情的分子調(diào)控機制將愈來愈清晰。

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